| รหัสโครงการ : | R000000649 |
| ชื่อโครงการ (ภาษาไทย) : | การประเมินจำนวนประชากรและการวิเคราะห์คาริโอไทป์ของสัตว์อันดับค้างคาว |
| ชื่อโครงการ (ภาษาอังกฤษ) : | Population estimation and Karyological analysis of the Orde Chiroptera |
| คำสำคัญของโครงการ(Keyword) : | ค้างคาว คาริโอไทป์ อิดิโอแกรม โครโมโซมเครื่องหมาย |
| หน่วยงานเจ้าของโครงการ : | คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี > ภาควิชาวิทยาศาสตร์ สาขาวิชาชีววิทยา และเทคโนโลยีชีวภาพ |
| ลักษณะโครงการวิจัย : | โครงการวิจัยเดี่ยว |
| ลักษณะย่อยโครงการวิจัย : | ไม่อยู่ภายใต้แผนงานวิจัย/ชุดโครงการวิจัย |
| ประเภทโครงการ : | โครงการวิจัยใหม่ |
| สถานะของโครงการ : | propersal |
| งบประมาณที่เสนอขอ : | 100000 |
| งบประมาณทั้งโครงการ : | 100,000.00 บาท |
| วันเริ่มต้นโครงการ : | 30 มีนาคม 2566 |
| วันสิ้นสุดโครงการ : | 29 มีนาคม 2567 |
| ประเภทของโครงการ : | การวิจัยพื้นฐาน |
| กลุ่มสาขาวิชาการ : | วิทยาศาสตร์ธรรมชาติ |
| สาขาวิชาการ : | สาขาเกษตรศาสตร์และชีววิทยา |
| กลุ่มวิชาการ : | วิทยาศาสตร์ชีวภาพ |
| ลักษณะโครงการวิจัย : | ระดับนานาชาติ |
| สะท้อนถึงการใช้ความรู้เชิงอัตลักษณ์ : | ไม่สะท้อนถึงการใช้ความรู้เชิงอัตลักษณ์ |
| สร้างความร่วมมือประหว่างประเทศ GMS : | ไม่สร้างความร่วมมือทางการวิจัยระหว่างประเทศ |
| นำไปใช้ในการพัฒนาคุณภาพการศึกษา : | นำไปใช้ประโยชน์ในการพัฒนาณภาพการศึกษา |
| เกิดจากความร่วมมือกับภาคการผลิต : | ไม่เกิดจากความร่วมมือกับภาคการผลิต |
| ความสำคัญและที่มาของปัญหา : | ค้างคาวเป็นสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (Class Mammalia) จัดอยู่ในอันดับไครอพเทอรา (Order Chiroptera) ทั่วโลกพบว่ามีจำนวนชนิดมากเป็นอันดับที่สองรองจากสัตว์ฟันแทะ (Order Rodentia) ค้างคาวเป็นสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมพวกเดียวที่บินได้อย่างแท้จริง มีปีกที่เกิดจากแผ่นหนัง (Membrane) ที่ขึงระหว่างส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย ทำหน้าที่ในการบิน หรือเปรียบได้กับขาหน้าของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมชนิดอื่น ๆ ค้างคาวที่สำรวจพบแล้วแบ่งออกได้เป็น 18 วงศ์ (Family) 188 สกุล (Genus) และพบประมาณ 977 ชนิด (Species) อันดับไครอพเทอราแบ่งย่อยออกเป็นอีก 2 อันดับย่อย (Suborder) คือ อันดับย่อยค้างคาวกินผลไม้และน้ำต้อย (Suborder Megachiroptera) พบ 1 วงศ์ และอันดับย่อยค้างคาวกินแมลง (Suborder Microchiroptera) พบ 17 วงศ์ สำหรับประเทศไทยสัตว์ในอันดับค้างคาวมีจำนวนชนิดมากที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับอันดับอื่น ๆ ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (ประทีป ด้วงแค, 2550) โดยมีรายงานการพบค้างคาวอย่างน้อย 138 ชนิด จาก 11 วงศ์ 45 สกุล ซึ่งนับว่าเป็นกลุ่มสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีความหลากหลายที่สุดที่พบในประเทศไทย (พิพัฒน์ สร้อยสุข, 2554) ค้างคาวส่วนใหญ่มักจะอยู่อาศัยรวมกันเป็นกลุ่มใหญ่แต่มีบางชนิดที่อาศัยอยู่เป็นกลุ่มหรือฝูงเล็ก ๆ และบางชนิดก็อยู่โดดเดี่ยว ค้างคาวจะอาศัยหลับนอนในพื้นที่ต่าง ๆ เช่น ตามถ้ำ (ทั้งถ้ำหินปูนและถ้ำดิน) โพรงไม้ โพรงดิน ใต้ใบไม้ กระบอกไม้ไผ่ หลืบ ซอกหิน หรือตามสิ่งปลูกสร้างที่มนุษย์สร้างขึ้น เช่น บ้านเรือน วัด ตึก เป็นต้น ค้างคาวมีบทบาทหน้าที่และมีประโยชน์มากมายต่อ ระบบนิเวศ เช่น ช่วยควบคุมแมลง ช่วยผสมเกสรและกระจายเมล็ดพันธุ์พืช มูลค้างคาวใช้ทำปุ๋ย เป็นต้น (กัลยาณี บุญเกิด และสไว วังหงษา, 2548; ประทีป ด้วงแค, 2550)
ถ้ำเขาฆ้องชัย ตั้งอยู่ในเขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน ต.ป่าอ้อ อ.ลานสัก จ.อุทัยธานี เป็นถ้ำที่มีความสูงประมาณ 353 เมตร จากระดับน้ำทะเลปานกลาง มีลักษณะเป็นถ้ำตื้นและกว้าง สันนิษฐานว่าถ้ำแห่งนี้น่าจะเคยมีมนุษย์ยุคก่อนประวัติศาสตร์อาศัยอยู่ เนื่องจากมีการค้นพบเครื่องมือหินและเศษภาชนะดินเผา พื้นที่ส่วนใหญ่มีลักษณะเป็นเขาหินปูน และเป็นหน้าผาสูงชัน มีรายงานการสำรวจพบสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม 27 ชนิด โดยพบค้างคาวมากกว่า 6 ชนิด เช่น ค้างคาวหน้ายักษ์สามหลืบ (Hipposideros larvatus) ค้างคาวหน้ายักษ์ทศกัณฑ์ (H armiger) ค้างคาวแวมไพร์แปลงเล็ก (Megaderma spasma) ค้างคาวมงกุฎมลายู (Rhinolophus malayanus) ค้างคาวปีกถุงเคราดำ (Taphozous melanopogon) และค้างคาวปากย่น (Tadarida plicata) เป็นต้น (ส่วนอนุรักษ์สัตว์ป่า กรมป่าไม้ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์, 2542) จึงทำให้เป็นจุดท่องเที่ยวสำคัญแห่งหนึ่ง เนื่องจากช่วงเย็นมักจะมีผู้คนมาชมฝูงค้างคาวบินออกหากิน
ปัจจุบันมีการศึกษาชีววิทยาของค้างคาวในแง่ต่าง ๆ อย่างหลากหลาย เพราะค้างคาวสามารถปรับตัวและเปลี่ยนแปลงโครงสร้างทางร่างกายมากกว่าสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมชนิดอื่น ๆ การศึกษาวิจัยส่วนใหญ่ทำในต่างประเทศ เช่น การศึกษาด้านอนุกรมวิธาน (Taxonomy) สัณฐานวิทยา (Morphology) กายวิภาค (Anatomy) สรีรวิทยา (Physiology) มิญชวิทยา (Histology) ชีววิทยาการเจริญ (Development biology) นิเวศวิทยา (Ecology) พฤติกรรม (Behavior) ระบบสืบพันธุ์ (Reproduction) การหาตำแหน่งด้วยคลื่นสะท้อน (Echolocation) พันธุศาสตร์ (Genetics) ชีววิทยาโมเลกุล (Molecular biology) และวิวัฒนาการ (Evolution) ซึ่งข้อมูลด้านต่าง ๆ เหล่านี้ของสัตว์กลุ่มค้างคาวในประเทศไทยถือว่าเป็นกลุ่มสัตว์ที่มีข้อมูลน้อยมาก ถึงแม้ว่าค้างคาวจะมีประชากรเป็นกลุ่มใหญ่ที่พบในประเทศไทยก็ตาม แต่การศึกษาวิจัยเกี่ยวกับค้างคาวในประเทศไทยมีน้อยมากและส่วนใหญ่ก็เป็นการศึกษาทางด้านอนุกรมวิธาน และสัณฐานวิทยาเป็นส่วนใหญ่ ส่วนการศึกษาทางด้านพลศาสตร์ประชากร (Population dynamics) และเซลล์พันธุศาสตร์ (Cytogenetics) พบว่ามีข้อมูลเพียงเล็กน้อย (Bumrungsri et al., 2006; Hood et al., 1988) ดังนั้น จึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องการศึกษาชีววิทยาของค้างคาวในด้านพลศาสตร์ประชากรและเซลล์พันธุศาสตร์ เนื่องจากค้างคาวบางชนิดถูกจัดเป็นสัตว์ที่ถูกคุกคามและใกล้สูญพันธุ์ (Endangered species) และมีการกระจายตัวในพื้นที่ที่จํากัดและเป็นสัตว์เฉพาะถิ่น (Endemic species)
ดังนั้น งานวิจัยนี้จึงสนใจที่จะทำการศึกษาเกี่ยวกับพลศาสตร์ประชากรและเซลล์พันธุศาสตร์ โดยการจัดทำคาริโอไทป์ (Karyotype) อิดิโอแกรมมาตรฐาน (Ideogram) และตรวจสอบโครโมโซมเครื่องหมาย (Chromosome marker) ของค้างคาว ที่ถ้ำเขาฆ้องชัย เขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน จังหวัดอุทัยธานี โดยหวังเป็นอย่างยิ่งว่าข้อมูลด้านพลศาสตร์ประชากรและด้านเซลล์พันธุศาสตร์ที่ได้จะนำไปสู่การวางแผนการอนุรักษ์ของสัตว์กลุ่มค้างคาวต่อไปในอนาคต นอกจากนี้ ข้อมูลที่ได้นี้ยังสามารถนำไปใช้ร่วมกับการศึกษาด้านอนุกรมในการจัดจำแนกชนิดค้างคาวได้อีกด้วย และยังเป็นข้อมูลพื้นฐานทางด้านเซลล์พันธุศาสตร์และเซลล์พันธุ์ศาสตร์ระดับโมแลกุลที่มีความจำเป็นอย่างยิ่งในการอนุรักษ์แหล่งพันธุกรรม ตลอดจนการศึกษาความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการกับสัตว์กลุ่มอื่น ๆ ได้ในอนาคต
|
| จุดเด่นของโครงการ : | - |
| วัตถุประสงค์ของโครงการ : | 1. เพื่อศึกษาจำนวนประชากรของค้างคาว ณ ถ้ำเขาฆ้องชัย เขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน อำเภอ ลานสัก จังหวัดอุทัยธานี
2. เพื่อศึกษาข้อมูลทางเซลล์พันธุศาสตร์ของค้างคาว
|
| ขอบเขตของโครงการ : | ทำการศึกษาจำนวนประชากรและพันธุศาสตร์ของเซลล์ของค้างคาวที่ถ้ำเขาฆ้องชัย เขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน จังหวัดอุทัยธานี โดยใช้เทคนิคการนับจำนวนประชากรด้วยการติดตั้งกล้องวงจรปิด (CCTV) พร้อมอุปกรณ์บันทึกข้อมูลสิ่งแวดล้อมภายในถ้ำ และทำการศึกษาเซลล์พันธุศาสตร์ โดยทำการวิเคราะห์ คาริโอไทป์โดยใช้เทคนิคการย้อมสีโครโมโซม (Giemsa staining) และการย้อมสีแบบนอร์ (Ag-NORs Banding Techniques) เพื่อตรวจสอบหาตำแหน่งเครื่องหมายของโครโมโซม (Marker chromosome) พร้อมทั้งจัดทำคาริโอไทป์และอิดิโอแกรมพื้นฐาน |
| ผลที่คาดว่าจะได้รับ : | 1. ทราบจำนวนประชากรค้างคาวที่ถ้ำเขาฆ้องชัย ในเขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน จังหวัดอุทัยธานี
2. ทราบการเปลี่ยนแปลงเชิงพลประชากรศาสตร์ของค้างคาวที่ถ้ำเขาฆ้องชัย
3. ทราบข้อมูลด้านเซลล์พันธุศาสตร์ของค้างคาว โดยการจัดทำคาริโอไทป์และอิดิโอแกรมมาตรฐาน
4. ทราบเครื่องหมายทางพันธุกรรมนิวคลีโอลัส ออร์กาไนเซอร์ รีเจียน (Nucleolus Organizer Region; NOR) ของค้างคาวที่ถ้ำเขาฆ้องชัย
5. เป็นข้อมูลพื้นฐานทางด้านเซลล์พันธุศาสตร์ของค้างคาว สำหรับใช้ในการศึกษาด้านพันธุศาสตร์และด้านอื่น ๆ ในการทำงานวิจัยในลำดับต่อไปในอนาคต
|
| การทบทวนวรรณกรรม/สารสนเทศ : | อนุกรมวิธานและลักษณะทั่วไปของค้างคาว
ค้างคาวเป็นสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (Class Mammalia) จัดอยู่ในอันดับไครอพทอรา (Order Chiroptera) ซึ่งมีความหลากหลายสูงเป็นอันดับสองรองจากสัตว์ฟันแทะ (Order Rodentia) ในปัจจุบันมีการค้นพบค้างคาวชนิดพันธุ์ใหม่อย่างต่อเนื่องจากการศึกษาและพัฒนาองค์ความรู้พื้นฐานทางอนุกรมวิธาน
ค้างคาวจัดเป็นสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเหมือนกับมนุษย์ โดยมีลักษณะร่วมกันทั้งการเป็นสัตว์เลือดอุ่น (Homeotherm) ที่มีขนปกคลุมทั่วร่างกาย มีการผลิตน้ำนมสำหรับเลี้ยงดูลูก มีความสามารถในการได้ยิน การมองเห็น หรือการดมกลิ่นเช่นเดียวกับมนุษย์ แต่อย่างไรก็ตามค้างคาวมีความสามารถพิเศษต่างจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมชนิดอื่น ๆ คือสามารถบินได้อย่างแท้จริง โดยค้างคาวเป็นสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมกลุ่มเดียวเท่านั้นที่มีปีกซึ่งเป็นพังผืดที่มีลักษณะคล้ายหนังแผ่ออกจากบริเวณด้านข้างของลำตัวทั้งสองข้างเชื่อมติดกับกระดูกขา กระดูกแขน และกระดูกนิ้วทั้งห้า การที่ค้างคาวสามารถบินได้นี้ทำให้พบค้างคาวได้แทบทุกที่ในทุกทวีป ยกเว้นเพียงทวีปอาร์คติกและแอนตาร์กติกเท่านั้น นอกจากนี้ ค้างคาวหลายชนิดสามารถปล่อยคลื่นความถี่สูง (20-200kHz) เพื่อใช้ในการระบุตำแหน่งของวัตถุผ่านการสะท้อนกลับ (Echolocation) ได้ ซึ่งทำให้ค้างคาวสามารถบินออกหากินได้แม้ในยามค่ำคืนที่มืดสนิท ทำให้ความมืดไม่เป็นอุปสรรคในการดำรงชีวิตของค้างคาว (ธงชัย งามประเสริฐวงศ์, 2560)
ปัจจุบันประเทศไทยมีรายงานพบค้างคาวจำนวน 138 ชนิด 11 วงศ์ 45 สกุล (พิพัฒน์ สร้อยสุข, 2554) โดยมีถิ่นที่อยู่อาศัยได้หลากหลาย เช่น ต้นไม้ อาคารบ้านเรือน ถ้ำ ซอกหิน และโพรงไม้ เป็นต้น สามารถพบค้างคาวได้ทั่วทุกภูมิภาคของประเทศไทย ค้างคาวที่พบในประเทศไทยมีความหลากหลายมากโดยพบตั้งแต่ค้างคาวที่มีขนาดเล็กที่สุดในโลก คือ ค้างคาวคุณกิตติ (Craseonycteris thonglongyai) ไปจนถึงค้างคาวที่มีขนาดใหญ่ที่สุดในโลกคือ ค้างคาวแม่ไก่ป่าฝน (Pteropus vampyrus) ค้างคาวที่พบในประเทศไทยแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม คือกลุ่มค้างคาวกินผลไม้ (Megachiroptera) และกลุ่มค้างคาวกินแมลง (Microchiroptera) (ปุญญพัฒน์ เศษวิสัย, 2558) ส่วนใหญ่ค้างคาวมักจะอาศัยอยู่รวมกันเป็นกลุ่มใหญ่ แต่ก็มีบางชนิดที่อาศัยอยู่เป็นกลุ่มหรือฝูงเล็ก ๆ และบางชนิดที่อยู่แบบโดดเดี่ยว (Lekagul and McNeely, 1988; ประทีป ด้วงแค, 2550)
ค้างคาวเป็นสัตว์ที่ถูกคุกคามและใกล้สูญพันธุ์ มีการกระจายในพื้นที่ที่จํากัดและเป็นสัตว์ถิ่นเดียว ตามพระราชบัญญัติสงวนและคุ้มครองสัตว์ป่า พ.ศ. 2535 ได้จัดค้างคาว 100 ชนิด เป็นสัตว์ป่าคุ้มครองซึ่งประกอบด้วยค้างคาวกินผลไม้ 10 ชนิด และค้างคาวกินแมลง 90 ชนิด (กัลยาณี บุญเกิด และสไว วังหงษา, 2548) ในประเทศไทยพบข้อมูลทางชีววิทยาของค้างคาวมีอยู่น้อยมากจึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องทำการศึกษาทางด้านชีววิทยาของค้างคาวในด้านต่าง ๆ อย่างเร่งด่วน โดยพื้นที่ที่ใช้ในการศึกษาคือ ถ้ำเขาฆ้องชัย เขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน จังหวัดอุทัยธานี พื้นที่ส่วนใหญ่มีลักษณะเป็นเขาหินปูน ทางด้านหน้าเป็นถ้ำตื้น กว้างเหมือนอุโมงค์ใหญ่ เชิงเขามีลักษณะเป็นหน้าผาสูงชันตลอด พบโพรงถ้ำตามธรรมชาติจำนวนมาก ลักษณะพืชพรรณบริเวณพื้นที่เขาฆ้องชัย แบ่งออกเป็น 2 ประเภท ได้แก่ ป่าดิบแล้งและป่าเบญจพรรณ พบสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม 27 ชนิด โดยพบค้างคาวมากกว่า 6 ชนิด เช่น ค้างคาวหน้ายักษ์สามหลืบ (Hipposideros larvatus) ค้างคาวหน้ายักษ์ทศกัณฑ์ (H armiger) ค้างคาวแวมไพร์แปลงเล็ก (Megaderma spasma) ค้างคาวมงกุฎมลายู (Rhinolophus malayanus) ค้างคาวปีกถุงเคราดำ (Taphozous melanopogon) และค้างคาวปากย่น (Tadarida plicata) เป็นต้น (ส่วนอนุรักษ์สัตว์ป่า กรมป่าไม้ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์, 2542)
การศึกษาพลศาสตร์ประชากร
พลศาสตร์ประชากร (population dynamics) หมายถึง การศึกษาเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงของประชากร รวมไปถึงปัจจัยทั้งหลายที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงประชากรนั้นด้วย การเปลี่ยนแปลงประชากรไม่ว่าจะเป็นการเพิ่มขึ้นหรือลดลง ซึ่งหมายถึงการเติบโตของประชากร (population growth) การเจริญเติบโตของประชากรในช่วงเวลาใดเวลาหนึ่ง หาได้จากจำนวนประชากรที่เกิดหรืออพยพเข้ามาทั้งหมด ลบด้วยประชากรที่ตายหรืออพยพออกไปทั้งหมด ประชากรในธรรมชาติส่วนใหญ่ การเพิ่มหรือลดขนาดประชากร มักจะเกิดจากอัตราการเกิดและอัตราการตายเป็นสำคัญ
การวิเคราะห์ประชากร (Population Analysis) เป็นเทคนิควิธีการขั้นพื้นฐานของการอนุรักษ์ไม่ว่าจะดำเนินการในพื้นที่ใด ๆ เช่น เขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่า อุทยานแห่งชาติ หรือเขตห้ามล่าสัตว์ป่า จะต้องมีข้อมูลที่ใช้ประกอบการพิจารณาอย่างน้อยที่สุดควรมี คือ ปริมาณหรือความหนาแน่นของประชากรสัตว์ หรือการปรากฏของชนิดพันธุ์สัตว์หรือไม่มีปรากฏในพื้นที่นั้น ๆ ในการวิเคราะห์ประชากรจึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งในการที่จะได้มาซึ่งข้อมูลประชากรที่เป็นประโยชน์ในการอนุรักษ์ การเปลี่ยนแปลงของประชากรไม่ว่าจะเพิ่มขึ้นหรือลดลง จะต้องพิจารณาถึงความสัมพันธ์ของการเปลี่ยนแปลงจำนวนประชากรกับปัจจัยแวดล้อม และอีกสาเหตุหนึ่งของการเปลี่ยนแปลงประชากรคือ การอพยพ (migration) สิ่งมีชีวิตแสดงพฤติกรรมการย้ายที่อยู่จากที่หนึ่งไปยังอีกที่หนึ่ง ซึ่งมีสิ่งจำเป็นพื้นฐานในการดำรงชีวิตในช่วงเวลาหนึ่ง ๆ ของชีวิต เพื่อการอยู่รอด การอพยพของสิ่งมีชีวิตมีวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกันไปแต่ละชนิด เช่น แหล่งอาหาร การหลีกหนีจากสัตว์ผู้ล่า รวมถึงสภาพอากาศที่เปลี่ยนแปลง
การวิเคราะห์ประชากรสามารถกระทำได้โดยการสำรวจชนิดและประชากร ซึ่งต้องใช้ความรู้ความสามารถของผู้ดำเนินการ ทั้งนี้เพราะสัตว์ที่พบในธรรมชาติมีการเคลื่อนที่และหลบซ่อนตัวอยู่ในป่าหรือถิ่นที่อาศัย วิธีการหากินที่แตกต่างกันตามเวลา เช่น หากินกลางคืนหรือหากินกลางวัน ในการสำรวจเราจะใช้วิธีสำรวจอย่างไรให้เหมาะสมในพื้นที่และเวลาใด เช่น การสำรวจบนเส้นทาง การสำรวจบนเส้นแนวผ่านสภาพถิ่นที่อาศัยชนิดต่าง ๆ การดักจับเป็น และการใช้อุปกรณ์ดักถ่ายภาพ เป็นต้น การพบเห็นตัวสัตว์หรือร่องรอยต้องจำแนกให้ถูกต้องแม่นยำ เป็นงานที่อาศัยศาสตร์และการประยุกต์ใช้แนวทางต่าง ๆ หลายวิธีการ เพื่อให้เหมาะสมกับชนิดพันธุ์สัตว์ พื้นที่ เวลา และ ฤดูกาล ตัวเลขที่เกี่ยวข้องกับความหนาแน่นของสัตว์ได้จากการประเมินประชากรสัตว์ (population estimation) (ทรงธรรม สุขสว่าง, 2560)
การประเมินจำนวนค้างคาวในแต่ละถ้ำจะใช้วิธีต่าง ๆ กัน ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับลักษณะของถ้ำและจำนวนค้างคาวในถ้ำ ซึ่งการนับจำนวนสามารถทำได้หลายวิธี ได้แก่ การนับด้วยสายตาโดยตรงภายในถ้ำ (Direct count) การนับจากภาพถ่าย (Photographic count) และการนับบริเวณปากถ้ำขณะค้างคาวบินออกหากิน (Emergence count) (Barcley and Bell, 1988) โดยในบางถ้ำอาจจะใช้หลายวิธีประกอบกันเพื่อให้ได้ข้อมูลมีความสมบูรณ์มากที่สุดก็ได้ ในกรณีของถ้ำที่เคยมีการประเมินจำนวนค้างคาวมาก่อนจะใช้วิธีการประเมินแบบเดิมและเพิ่มวิธีการอื่น ซึ่งเป็นวิธีมาตรฐานในการติดตามจำนวนประชากร
จากการทบทวนรายงานวิจัยพบว่า มีรายงานการศึกษาพลศาสตร์ประชากรของสัตว์กลุ่มค้างคาวในประเทศไทยจำนวนน้อยมาก และมีการใช้วิธีการนับที่แตกต่างกันขึ้นอยู่ตามลักษณะของถิ่นที่อยู่อาศัย และปัจจัยแวดล้อมอื่น ๆ จากรายงานการวิจัยของกัลยาณี บุญเกิด และสไว วังหงษา (2548) ที่ได้ทำการศึกษาประชากรของค้างคาวแม่ไก่ภาคกลาง ที่อาศัยอยู่ในวัดหลวงพรมมาวาส จังหวัดชลบุรี โดยวิธีการนับตัวโดยตรง ทำการแบ่งพื้นที่วัดหลวงพรหมาวาส ออกเป็น 10 ส่วนแล้วให้เจ้าหน้าที่ 10 คน เข้าประจำในแต่ละส่วน ทำการนับจำนวนค้างคาวเป็นเวลา 30 นาที พบว่ามีประชากรค้างคาวแม่ไก่ทั้งสิ้น 9,027 ตัว ประชากรกลุ่มนี้มีอัตราการตายและการอพยพออกนอกพื้นที่ก่อนถึงฤดูสืบพันธุ์ถัดไปประมาณ 8.70% และมีอัตราการเพิ่มประชากรปีละ 26.56% ในปี พ.ศ.2544-2548 และรายงานการวิจัยของเจนจิรา ฟุ้งจันทึก (2559) ได้ทำศึกษาการประเมินประชากรค้างคาวหน้ายักษ์สามหลืบด้วยวิธีการติดกล้องวงจรปิดระบบอินฟาเรด (CCTV) ไว้ที่ปากถ้ำเขาฆ้องชัย ซึ่งเป็นพื้นที่ที่จะทำวิจัยในครั้งนี้ พบว่าจำนวนประชากรของค้างคาวหน้ายักษ์สามหลืบ (Hipposideros larvatus) ในเดือนกรกฎาคม สิงหาคม กันยายน และตุลาคม 2555 นับประชากรเฉลี่ยได้ 18,770 17,100 15,470 และ 5,163 ตัว ตามลำดับ ในเดือนพฤศจิกายน ธันวาคม 2555 และเดือนมกราคม 2556 พบว่าไม่มีค้างคาวบินผ่านหน้ากล้องวงจรปิด จึงกล่าวได้ว่าช่วงดังกล่าวไม่มีประชากรอาศัยอยู่ในถ้ำที่ศึกษา และในเดือนมีนาคม เมษายน และพฤษภาคม 2556 นับประชากรเฉลี่ยได้ 16,275 20,888 และ 21,190 ตัว ตามลำดับ แสดงให้เห็นถึงแนวโน้มการเปลี่ยนแปลงประชากรค้างคาวในถ้ำว่าเริ่มมีการลดจำนวนลงตั้งแต่ช่วงปลายเดือนกันยายนจนถึงสิ้นเดือนตุลาคม และประชากรค้างคาวในถ้ำจะเริ่มเพิ่มขึ้นตั้งแต่ช่วงเดือนมีนาคมจนถึงเดือนพฤษภาคม ซึ่งคาดว่ามีพฤติกรรมการอพยพออกจากถ้ำที่อาศัยอยู่นี้ในบางช่วงของเดือนของแต่ละปี
การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมโดยใช้เซลล์พันธุศาสตร์
เซลล์พันธุศาสตร์ (Cytogenetics) เป็นสาขาที่ศึกษาเกี่ยวกับโครโมโซม และบทบาทการถ่ายทอดลักษณะทางพันธุกรรม โครโมโซมเป็นโครงสร้างสำคัญในการถ่ายทอดและแสดงออกของข้อมูลพันธุกรรม และเป็นตำแหน่งที่อยู่ของยีนซึ่งเป็นตัวควบคุมลักษณะต่าง ๆ ของสิ่งมีชีวิต ถ้าสิ่งมีชีวิตใดมีการเปลี่ยนแปลงของโครโมโซมย่อมส่งผลต่อการถ่ายทอดทางพันธุกรรมทำให้เกิดการแสดงออกในสิ่งมีชีวิตในรูปแบบที่แตกต่างกัน มีผลต่อการเจริญพัฒนาและวิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิต การศึกษาโครโมโซมเพื่อตรวจสอบจำนวน ขนาดและรูปร่างของโครโมโซมมีหลายวิธีส่วนใหญ่จะศึกษารูปร่างโครโมโซมในเซลล์ระยะเมทาเฟส (Metaphase) เนื่องจากเป็นระยะที่โครโมโซมมีการหดตัว (Contraction) สั้นมากที่สุด จึงทำให้สามาถมองเห็นลักษณะโครโมโซมได้ชัดเจนที่สุด รูปร่างของโครโมโซมโดยทั่วไปจึงหมายถึงรูปร่างในระยะเมทาเฟส ซึ่งจะประกอบด้วยโครมาทิด 2 เส้นติดกันที่ตำแหน่งที่เรียกว่า เซนโทรเมียร์ (Centromere) โดยตำแหน่งของเซนโทรเมียร์บนโครโมโซมแต่ละแท่งจะมีความจำเพาะและคงที่เสมอ ส่วนของโครโมโซมที่ยื่นออกมาจากเซนโทรเมียร์เรียกว่า แขน (Arm) ส่วนที่สั้นเรียกว่า แขนข้างสั้น (Short arm; p) ส่วนที่ยาวกว่าเรียกว่า แขนข้างยาว (Long arm; q) โครโมโซมจะมีการจำลองตัวเองได้ขณะที่อยู่ในระยะอินเตอร์เฟส (Interphase) ของวัฏจักรเซลล์ ดังนั้น การเก็บเกี่ยวเซลล์ในระยะเมทาเฟส จึงมีการใช้สารโคลชิซิน (Colchicine) เพื่อยับยั้งการสร้างสายใยสปินเดิล (Spindle fiber) ทำให้เซลล์ที่มีการแบ่งตัวไม่สามารถเข้าสู่ระยะแอนาเฟส (Anaphase) ได้ และใช้สารละลายไฮโปโทนิก (Hypotonic solution) ให้กับเซลล์ช่วยทำให้เซลล์พองตัวมากขึ้น มีการกระจายตัวของโครโมโซมที่ดี ทำให้สามารถตรวจนับจำนวน ขนาดและสังเกตรูปร่างชัดเจน วิธีการเตรียมโครโมโซมแบ่งออกเป็น 2 วิธี คือ
1. วิธีโดยตรง (Direct chromosome preparation) เป็นวิธีที่เลือกเอาเซลล์ในร่างกายที่กำลังแบ่งตัว
มาศึกษาโครโมโซม เป็นเซลล์ที่ยังอ่อนและยังมีการแบ่งตัวอยู่ตลอดเวลา เช่น เซลล์เม็ดเลือดจากไขกระดูก
2. วิธีโดยอ้อม (Indirect chromosome preparation) จะเลือกเซลล์ในร่างกายชนิดที่สามารถนำมา
เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเซลล์ภายนอกร่างกาย ให้เซลล์เกิดการแบ่งตัว
การเตรียมโครโมโซมเมื่อเก็บเกี่ยวเซลล์และหยดลงบนสไลด์แล้ว จะถูกนำมาทำการย้อมสีโครโมโซม เพื่อศึกษาโครโมโซมภายใต้กล้องจุลทรรศน์ได้ชัดเจน สามารถมองเห็นลักษณะรูปร่างและนับจำนวนโครโมโซมได้อย่างถูกต้อง รูปร่างของโครโมโซมแบ่งออกเป็น 4 ชนิด โดยอาศัยตำแหน่งของเซนโทรเมียร์เป็นหลัก โดยมีรายละเอียดดังนี้
1. โครโมโซมชนิดเมทาเซนทริก (Metacentric chromosome) เป็นโครโมโซมที่มีตำแหน่งของเซน-
โทรเมียร์อยู่ตรงกลาง ทำให้แขนทั้งสองข้างของโครโมโซมมีขนาดเท่ากัน หรือใกล้เคียงกัน
2. โครโมโซมชนิดซับเมทาเซนทริก (Submetacentric chromosome) เป็นโครโมโซมที่มีตำแหน่ง
ของเซนโทรเมียร์ค่อนไปทางปลายด้านใดด้านหนึ่ง ทำให้แขนข้างยาวมีความยาวกว่าแขนข้างสั้นอย่างเห็นได้ชัด
3. โครโมโซมชนิดอะโครเซนทริก (Acrocentric chromosome) เป็นโครโมโซมที่มีตำแหน่งของเซน-
โทรเมียร์ค่อนไปทางปลายด้านใดด้านหนึ่งมากจนเกือบอยู่ปลายสุดของแท่งโครโมโซม โครโมโซมที่มีรูปร่างแบบนี้บางทีอาจพบโครงสร้างพิเศษคล้ายกระเปราะ ติดอยู่ที่ปลายสุดของโครโมโซมในส่วนแขนข้างสั้น การที่ส่วนปลายแขนข้างสั้นมีลักษณะเช่นนี้บางทีจึงเรียกโครโมโซมแบบนี้ว่า โครโมโซมชนิดซับเทโลเซนทริก (Subtelocentric chromosome)
4. โครโมโซมชนิดเทโลเซนทริก (Telocentric chromosome) เป็นโครโมโซมที่มีตำแหน่งเซนโทร-
เมียร์อยู่ตรงปลายสุดของแท่งโครโมโซม ทำให้แขนโครโมโซมมีแขนข้างเดียว ไม่มีการแยกเป็นแขนข้างสั้นและแขนข้างยาว
?
ภาพที่ 1 ชนิดของโครโมโซม
ที่มา: อลงกลด แทนออมทอง, 2554
การจัดทำคาริโอไทป์และอิดิโอแกรม
คาริโอไทป์ (Karyotype) คือ การศึกษารายละเอียดของโครโมโซมทั้งหมดในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต (Chromosome complement) แต่ละชนิด โดยศึกษาทั้งจำนวน รูปร่าง และขนาดของโครโมโซม ในการจัดทำคาริโอไทป์จะนำโครโมโซมแต่ละแท่งจากระยะเมทาเฟส โดยใช้เซลล์ใดเซลล์หนึ่งเท่านั้น มาจัดเรียงเป็นคู่ของคู่โครโมโซมคู่เหมือน โดยเรียงจากคู่ที่มีขนาดใหญ่สุดไปหาคู่ที่มีขนาดเล็กสุด การวางโครโมโซมจะวางให้แขนข้างสั้นตั้งขึ้น และนิยมวางโครโมโซมเพศอยู่มุมล่างขวาสุดของคาริโอไทป์
อิดิโอแกรม (Idiogram) เป็นไดอะแกรมแสดงคาริโอไทป์ของโครโมโซม 1 ชุดแฮพลอยด์ (n) ซึ่งประกอบด้วยโครโมโซมร่างกาย และโครโมโซมเพศ โดยจะใช้ข้อมูลค่าเฉลี่ยความยาวของโครโมโซม จำนวน รูปร่างและขนาดของโครโมโซม รวมทั้งตำแหน่งของเซนโทรเมียร์ และรอยคอดที่สอง (Secondary constriction) โดย 1 แท่งของอิดิโอแกรมจะเท่ากับ 1 คู่ของโครโมโซม อิดิโอแกรมนิยมนำมาใช้ในงานเปรียบเทียบโครโมโซมของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด เพื่อศึกษาเกี่ยวกับวิวัฒนาการ
จากการทบทวนรายงานวิจัย พบว่า มีรายงานการศึกษาเซลล์พันธุศาสตร์เกี่ยวกับโครโมโซมและ คาริโอไทป์ของสัตว์กลุ่มค้างคาวหลายชนิดทั้งในประเทศและต่างประเทศ
Harada et al. (1985) ศึกษาพันธุศาสตร์เซลล์ของค้างคาววงศ์ Rhinolophidae ในประเทศไทยจำนวน 6 ชนิด เตรียมโครโมโซมจากไขกระดูก และเพาะเลี้ยงเซลล์ไฟโบรบลาสต์จากปอด ย้อมสีโครโมโซมแบบธรรมดา ได้ผลการศึกษาดังนี้ Rhinolophus pusillus (2n=62), R. affinis (2n=62), R. Stheno (2n=62), R. marshalli (2n=62), R. yunanensis (2n=60) และ R. luctus perniger (2n=32) ค้างคาวทั้ง 6 ชนิดมีนอร์ (Nucleolar organizer regions, NORs) อย่างละ 1 คู่ และพบว่าการเปลี่ยนแปลงของโครโมโซมเกิดจาก Robertsonian fusion
Hood et al. (1988) ศึกษาพันธุศาสตร์เซลล์ของค้างคาวในประเทศไทย 19 ชนิด 5 วงศ์ ได้ผลการศึกษาดังนี้ วงศ์ Pterpodidae ได้แก่ Rousettus amplexicaudatus (2n=36), Pteorpus lylei (2n=40), Cynopterus sphinx (2n=34), Megaerops niphanae (2n=26), Eonycteris spelaea (2n=36) และ Macroglossus sobrinus (2n=34) วงศ์ Emballonnuridae ได้แก่ Emballonura monticola (2n=24) และ Taphozous melanopogon (2n=42) วงศ์ Megadermatidae ได้แก่ Megaderma lyra (2n=54) และ M. spasma (2n=38) วงศ์ Rhinolophidae ได้แก่ Rhinolophus acuminatus (2n=62), R. affinis (2n=62), R. coelophyllus (2n=62), R. luctus (2n=32), R. malayanus (2n=62) วงศ์ Hipposideridae ได้แก่ Hipposideros armiger (2n=32), H. fulvus (2n=32), H. larvatus (2n=32) และ H. lekaguli (2n=32)
นฤมล ประครองรักษ์ และคณะ. (2555) ศึกษาพันธุศาสตร์เซลล์ของค้างคาวในพื้นที่ภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทยจำนวน 5 ชนิด ได้ผลการศึกษาดังนี้ ค้างคาวหูหนูตีนโตเล็ก (Myotis horsfiledii) (2n=44), ค้างคาวเพดานเล็ก (Scotophilus kuhlii) (2n=36), ค้างคาวปีกถุงเคราดำ (Taphozous melanopogon) (2n=42), ค้างคาวมงกุฎเล็ก (Rhinolophus pusillus) (2n=62) และค้างคาวหน้ายักษ์สามหลืบ (Hipposideros larvatus) (2n=32)
อลงกลด แทนออมทอง และคณะ. (2557) ศึกษาพันธุศาสตร์เซลล์ของค้างคาวแม่ไก่ป่าฝน (Pteropus vampyrus) ในประเทศไทย พบว่าค้างคาวแม่ไก่ป่าฝนมีจำนวนโครโมโซมดิพลอยด? (2n) เท?ากับ 38 แท่ง มีจำนวนโครโมโซมพื้นฐาน (NF) เท?ากับ 72 ทั้งในเพศผู้และในเพศเมีย
ดังนั้น งานวิจัยนี้จึงสนใจที่จะทำการศึกษาการพลศาสตร์ประชากร และศึกษาเซลล์พันธุศาสตร์ของค้างคาว ที่ถ้ำเขาฆ้องชัย อ.ลานสัก จ.อุทัยธานี โดยคาดหวังว่าข้อมูลที่ได้จะนำไปสู่การอนุรักษ์และใช้เป็นข้อมูลพื้นฐานด้านเซลล์พันธุศาสตร์เพื่อนำไปต่อยอดงานวิจัยอื่น ๆ ในอนาคตต่อไป
|
| ทฤษฎี สมมุติฐาน กรอบแนวความคิด : | - |
| วิธีการดำเนินการวิจัย และสถานที่ทำการทดลอง/เก็บข้อมูล : | 1. พื้นที่ทำการวิจัย
บริเวณถ้ำเขาฆ้องชัย เขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน จังหวัดอุทัยธานี พื้นที่ส่วนใหญ่มีลักษณะเป็นเขาหินปูน ทางด้านหน้าเป็นถ้ำตื้น กว้างเหมือนอุโมงค์ใหญ่ เชิงเขามีลักษณะเป็นหน้าผาสูงชันตลอด พบว่ามีค้างคาวอาศัยรวมกลุ่มกันอยู่
ภาพที่ 2 ถ้ำเขาฆ้องชัย เขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน จังหวัดอุทัยธานี
ที่มา: องค์การบริหารส่วนตำบลป่าอ้อ อำเภอลานสัก จังหวัดอุทัยธานี
2. การศึกษาจำนวนประชากร
2.1 การติดตั้งกล้องวงจรปิด
กำหนดจุดตั้งกล้องวงจรปิด (Closed-circuit television camera) เพื่อศึกษาพลวัตรประชากรโดยทำการติดตั้งกล้องวงจรปิดจำนวน 1 ตัว หน้าปากถ้ำเขาฆ้องชัย ซึ่งเป็นบริเวณทางเข้า-ออกจากถ้ำของค้างคาว โดยติดตั้งให้ตัวกล้องห่างจากบริเวณที่ค้างคาวเกาะเป็นระยะประมาณ 0.5 – 3 เมตร เพื่อไม่ให้เป็นการรบกวนค้างคาว และทำการบันทึกภาพเคลื่อนไหวตลอดเวลานาน 24 ชั่วโมง (Continuous recording) พร้อมทั้งทำการติดตั้งเครื่องวัดอุณหภูมิและความชื้นสัมพัทธ์ (Data logger) ภายในถ้ำ (ผนังถ้ำ) จำนวน 1 ชุด และนอกถ้ำจำนวน 1 ชุด โดยตั้งค่าการบันทึกข้อมูลทุก ๆ 30 นาที
2.2 การศึกษาพลศาสตร์ประชากร
จากการติดตั้งกล้อง 1 ตัวบริเวณปากถ้ำ (ทางเข้า-ออก) เพื่อสำรวจจำนวนประชากรของค้างคาวภายในถ้ำตลอดระยะเวลาที่ทำการศึกษาในช่วงเดือนมกราคมจนถึงเดือนมิถุนายน 2565 โดยจะทำการบันทึกวีดีโอเพื่อนับจำนวนประชาการค้างคาวภายในถ้ำจำนวน 6 ครั้ง จากนั้นนำข้อมูลที่ได้มาวิเคราะห์หาค่าสหสัมพันธ์ระหว่างจำนวนประชากรที่เปลี่ยนแปลงกับปัจจัยแวดล้อมภายในถ้ำ ได้แก่ อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส) และปริมาณความชื้นสัมพัทธ์ (%)
การศึกษาช่วงเวลาเริ่มการออกหากิน (Emergence time) ของค้างคาว โดยการคำนวณหาความสัมพันธ์กับปัจจัยที่คาดว่าจะมีผลต่อช่วงเวลาการออกหากินของค้างคาว ได้แก่ อุณหภูมิ ปริมาณความชื้นสัมพัทธ์ และเวลาดวงอาทิตย์ตก โดยในการประเมินช่วงเวลาการออกหากินของค้างคาว จะวัดจากประชากรค้างคาวกลุ่มแรกที่เริ่มบินออกจากถ้ำ โดยจะระบุเวลาที่ชัดเจนในการเริ่มบินออกจากถ้ำได้จากข้อมูลภาพเคลื่อนไหวโดยใช้แนวทางการศึกษาของ Bullock et al. (1987)
2.3 การวิเคราะห์ข้อมูล
การนับจำนวนประชากรในถ้ำ ดำเนินการโดยใช้วิธีการนับค้างคาวขณะบินออกจากถ้ำจากภาพเคลื่อนไหวที่บันทึกไว้ โดยทำการสุ่มนับค้างคาว 10% ของค้างคาวทั้งหมด โดยนับจำนวนค้างคาวทุก ๆ 6 วินาที ในเวลา 1 นาที ตั้งแต่ค้างคาวเริ่มบินออกจากถ้ำจนกระทั่งค้างคาวบินออกจากถ้ำทั้งหมด แล้วมาคำนวณหาจำนวนค้างคาวในทุก ๆ 1 นาที จะได้จำนวนประชากรทั้งหมดของค้างคาวที่บินออกจากถ้ำ ณ วันที่สำรวจ แล้วมาคำนวณหาจำนวนประชากรค้างคาวโดยใช้สูตรดังนี้
จำนวนค้างคาวใน 6 วินาที ? 10 = จำนวนค้างคาวใน 1 นาที
จำนวนค้างคาวใน 1 นาที x ระยะเวลาที่ค้างคาวบินออก (นาที) = จำนวนค้างคาวทั้งหมด
นำข้อมูลประชากรค้างคาวภายในถ้ำมาทำการวิเคราะห์ช่วงเวลาการออกหากิน (Emergence time) โดยใช้การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ (Correlation analysis) และการวิเคราะห์การถดถอย (Regression analysis) เพื่อหาความสัมพันธ์ของปัจจัยแวดล้อมที่มีผลต่อเวลาการบินออกหากิน (เจนจิรา ฟุ้งจันทึก, 2559)
3. การศึกษาพันธุศาสตร์เซลล์
3.1 การเก็บตัวอย่างและระบุชนิดค้างคาว
ทำการดักจับสัตว์อันดับค้างคาว โดยใช้ตาข่ายดักจับบริเวณปากถ้ำเขาฆ้องชัย เขตห้ามล่าสัตว์ป่าถ้ำประทุน จังหวัดอุทัยธานี จำนวน 6 ตัว เมื่อได้ตัวอย่างมาแล้วทำการสังเกตลักษณะภายนอก เช่น ใบหู ดวงตา เล็บ สีขน กลีบจมูก หาง ฯลฯ วัดค่าทางสัณฐานวิทยาต่าง ๆ ของร่างกาย ได้แก่ ความยาวท่อนแขนหน้า (Forearm length, FA) ความยาวหัวและลำตัว (Head-body length, HB) ความยาวหาง (tail length, T) ความยาวใบหู (Ear length, E) ความยาวแข้ง (Tibia length, Ti) ความยาวเท้าหลัง (Metatarsus length, M) และวัดค่าสัณฐานวิทยาของกระโหลก ได้แก่ Greatest length of skull (GTL), Condylo-basal length (CBL), Condylo-canine length (CCL), Zygomatic breadth (ZB), Breadth of braincase (BB), Interorbial constriction (IC), Postorbital constriction (PC), Rostral width (RW), Mandible length (ML), Maxillary toothrow (C-M1), Mandibulary toothrow (C-M2), Posterior palatal width (M1-M1) และ Anterior palatal width (C1-C1) นำตัวอย่างค้างคาวมาระบุชนิดตามรูปวิธาน (Key) ดังต่อไปนี้
1) ประทีป ด้วงแค. (2550). ค้างคาวเมืองไทย สำหรับการจำแนกชนิดในภาคสนาม. กรุงเทพฯ: ภาควิชาชีววิทยา ป่าไม้ คณะวนศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์.
2) Francis, C. M. (2008). A Field Guide to the Mammals of Thailand and South-East Asia. Bangkok: Asia Book.
3) Lekagul, B. and McNeely, J. A. (1988). Mammals of Thailand (2nded). SahaKarnBhaet, Bangkok.
3.2 การเตรียมโครโมโซมเพื่อการศึกษาพันธุศาสตร์เซลล์ของค้างคาว
เตรียมโครโมโซมระยะเมทาเฟสโดยเตรียมจากเซลล์ไขกระดูกในกรณีที่ค้างคาวมีขนาดเล็ก (FA น้อยกว่า 70 มม.) วิธีเตรียมโครโมโซมดัดแปลงจาก อมรา คัมภิรานนท์ (2546) และอลงกลด แทนออมทอง (2554)
3.2.1 การเตรียมโครโมโซมจากไขกระดูก
(1) เตรียมโครโมโซมจากไขกระดูก โดยฉีดโคชิซิน (Colchicine) ความเข้มข้นร้อยละ 0.1 เข้าที่บริเวณช่องท้องของค้างคาวในอัตราส่วน 0.1 มิลลิลิตรต่อน้ำหนักตัว 10 กรัม ทิ้งไว้ประมาณ 12 ชั่วโมง
(2) ทำให้ค้างคาวสลบโดยวิธีการใช้ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ (CO2)
(3) ผ่าตัดเอากระดูกโคนปีก (humerus = hu), กระดูกกลางป?ก (forearm = fa), กระดูกปลายป?ก (metacarpal) และกระดูกโคนขา (femur = fe) โดยการเลาะเอากล้ามเนื้อติดกระดูกและตัดเอากระดูกส่วนอิพิไฟซิส (Epiphysis) ออก
(4) แช่กระดูกที่ได้ในโพแทสเซียมคลอไรด์ (KCl) ความเข้มข้น 0.075 โมลาร์ (M) จากนั้นใช้เข็มฉีดยาดูดโพแทสเซียมคลอไรด์ ฉีดเข้าไปในโพรงกระดูกเพื่อไล่เอาไขกระดูกออกมา และทำการสับไขกระดูกให้ละเอียดด้วยกรรไกรผ่าตัด
(5) บ่มไขกระดูกในโพแทสเซียมคลอไรด์ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30-40 นาที เพื่อทำให้เซลล์ พองบวม มีผลทำให้โครโมโซมเกิดการกระจายตัวดี
(6) นำสารละลายตัวอย่างใส่ในหลอดปั่นเหวี่ยงเติมโพแทสเซียมคลอไรด์ให้ได้ปริมาตร 7 มิลลิลิตร นำไปปั่นเหวี่ยงที่ 2,700 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที เพื่อแยกตะกอนเซลล์ออกจากสารละลาย โพแทสเซียมคลอไรด์
(7) ดูดเอาสารส่วนใส (Supernatant) ด้านบนทิ้ง จากนั้นทำการตรึงเซลล์ (Fixation) โดยการเติมน้ำยาตรึงเซลล์ชนิด Canoy’s fixative ที่แช่เย็นและเตรียมใหม่เสมอ ที่มีอัตราส่วนของ เมทานอล (Methanol) ต่อกรดอะซิตริกเข้มข้น (Glacial acetic acid) ในอัตราส่วน 3:1 ค่อย ๆ เติมทีละหยดผสมให้เข้ากัน จนได้ปริมาตร 7 มิลลิลิตร
(8) นำไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 2,700 รอบ/นาที เป็นเวลา 10 นาที ทำซ้ำข้อ 6 และข้อ 7 ประมาณ 3-4 ครั้ง เพื่อล้างตะกอนเซลล์ให้สะอาด จะได้ตะกอนสีขาวที่ก้นหลอด
(9) ดูดสารละลายส่วนบนทิ้งไปเกือบหมดเหลือไว้เหนือเซลล์หรือตะกอนสีขาวประมาณ 0.5-1 มิลลิลิตร เติมน้ำยาตรึงเซลล์ (Fixative) อีกประมาณ 1-2 มิลลิลิตร (ขึ้นกับปริมาณตะกอนเซลล์) ผสมให้เข้ากัน เก็บตะกอนเซลล์ในสารละลายตรึงเซลล์ไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนำมาทำการศึกษา
3.3 การเตรียมสไลด์โครโมโซม
หยด fixative 2 หยด โดยไม่ซ้ำตำแหน่งเดิมบนสไลด์ที่แห้งและสะอาด แล้วทำการหยดสารละลายตะกอนเซลล์ตาม จากนั้นนำสไลด์มาวางบน hot plate ที่มีผ้าพรมน้ำคลุมอยู่ และหยดเซลล์สูงประมาณ 1-2 ฟุต เพื่อไม่ให้เซลล์ซ้อนทับกัน ทิ้งไว้ให้แห้ง เพื่อเตรียมไว้สำหรับย้อมสีในขั้นตอนต่อไป
3.4 การย้อมสีโครโมโซม
หลังจากเตรียมสไลด์โครโมโซมเสร็จเรียบร้อยแล้ว นำมาทำการย้อมสีเพื่อให้สามารถตรวจสอบโครโมโซมได้ชัดเจนภายใต้กล้องจุลทรรศน์ และเพื่อการตรวจสอบเฉพาะโครงสร้างบางส่วนของโครโมโซม โดยใช้เทคนิคการย้อมสีแบบธรรมดา (Conventional staining) และการย้อมแถบสีแบบนอร์ โดยดัดแปลงจาก Verma and Babu (1995)
3.4.1. การย้อมสีโครโมโซมแบบธรรมดา
ทำการย้อมสีโครโมโซมแบบธรรมดาด้วยสีจิมซ่า (Giemsa’s solution) ความเข้มข้น 20 เปอร์เซ็นต์ ที่มีส่วนผสมของ Stock Giemsa’s solution ละลายในโซเรนเซนบัฟเฟอร์ (Sorensen buffer) ความเป็นกรดเป็นด่าง 6.8 แล้วกรอง ทิ้งไว้ประมาณ 15-30 นาที แล้วล้างสีออกด้วยน้ำกลั่น ทิ้งไว้ให้แห้ง จากนั้นนำไปตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่กำลังขยาย 100X
3.4.2. การย้อมสีโครโมโซมแบบนอร์
นำสไลด์ที่หยดเซลล์แล้วไปอบที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 ชั่วโมง จากนั้นหยดสารละลาย 2% Gelatin 3 หยด แล้วหยดสารละลาย 50% AgNO3 6 หยด (2 ตำแหน่ง) ปิดด้วยกระจกปิดสไลด์ นำเข้าตู้อบที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5-8 นาที หรือจนกว่าสไลด์จะเปลี่ยนเป็นสีเหลืองเข้ม (ห้ามทิ้งไว้นานจนสไลด์เปลี่ยนเป็นสีน้ำตาลโดยเด็ดขาด) แล้วล้างโดยการจุ่มสไลด์ลงในภาชนะที่มีน้ำไหลผ่านตลอดเวลาอย่างรวดเร็ว เพื่อให้กระจกปิดสไลด์หลุดออก ทิ้งไว้ให้แห้ง นำไปตรวจสอบโครโมโซมภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่กำลังขยาย 100X
3.5 การตรวจสอบโครโมโซม
เลือกเซลล์ที่มีโครโมโซมระยะเมทาเฟสกระจายตัวดีไม่ซ้อนทับกัน นำมาถ่ายภาพ โครโมโซมโดยใช้เลนส์วัตถุ (objective lens) กำลังขยาย 100X เลนส์ใกล้ตากำลังขยาย 10x โดยใช้กล้องดิจิตอลเลนส์ใกล้กล้องถ่ายภาพกำลังขยาย 2.5x เพื่อตรวจนับจำนวนโครโมโซมจากภาพถ่ายโครโมโซมจำนวน 20 เซลล์ ความถี่ของจำนวนโครโมโซมที่พบมากที่สุด จะเป็นค่าของจำนวนโครโมโซมดิพลอยด์ของค้างคาว
3.6 การจัดทำคาริโอไทป์
การตรวจสอบโครโมโซม จัดทำคาริโอไทป์ และอิดิโอแกรมในครั้งนี้ ดัดแปลงจากวิธีการของกันยารัตน์ ไชยสุต (2532)
คาริโอไทป์ คือ การศึกษารายละเอียดของโครโมโซมทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด โดยศึกษาทั้งจำนวนโครโมโซม และรูปร่างโครโมโซม การสร้างคาริโอไทป์ใช้โครโมโซมจากระยะเมทาเฟสเพียง 1 เซลล์ มาเป็นตัวแทนของสิ่งมีชีวิตชนิดนั้น ขั้นตอนการจัดทำคาริโอไทป์ มีดังนี้
(1) เลือกเซลล์ในระยะเมทาเฟสที่โครโมโซมไม่ยาวหรือสั้นเกินไป มีการกระจายที่ดี ไม่ ซับซ้อนทับกัน และนับจำนวนโครโมโซมได้ครบเท่ากับจำนวนโครโมโซมของสิ่งมีชีวิตชนิดนั้น ถ่ายภาพเซลล์ที่เลือกไว้โดยใช้เลนส์วัตถุกำลังขยาย 100X
(2) ใช้รูปถ่ายจากการจับคู่โครโมโซมคู่เหมือน (homologous chromosome) โดยการกำหนดตำแหน่งของเซนโทรเมียร์ ของโครโมโซมแต่ละแท่งในเซลล์ จากนั้นวัดค่าความยาวของแขนโครโมโซมข้างยาว (long arm; Ll) ความยาวของแขนโครโมโซมข้างสั้น (short arm; Ls) นำค่าที่ได้มาคำนวณหาความยาวของโครโมโซมแต่ละแท่ง (total length; LT, LT = Ll + Ls) คำนวณค่า relative length (RL) และ centromeric index (CI) เพื่อระบุชนิดของโครโมโซม
การวัดค่าความยาวของโครโมโซมอาจจะใช้วิธีการตัดโครโมโซมออกมาจากรูปถ่ายทีละแท่ง กำหนดหมายเลขให้โครโมโซมทุกแท่งก่อนการวัด เมื่อวัดความยาวเสร็จแล้วจึงจับคู่โครโมโซมที่มีความยาวของแขนแต่ละข้าง และความยาวทั้งแท่งใกล้เคียงกนมากที่สุด
(3) คำนวณหาค่าความยาวสัมพัทธ์ (Relative length; RL) คำนวณได้จากสูตร ดังนี้
ค่า Relative length (RL) = "ความยาวของโครโมโซมแต่ละแท่ง (LT) " /"ความยาวทั้งหมดของโครโมโซมทุกแท่ง (?LT)"
การใช้ค่า RL สามารถช่วยในการจับคู่โครโมโซมที่มีความแน่นอนกว่าการใช้ค่าความยาวของ โครโมโซม เพราะค่า RL ของโครโมโซมแต่ละแท่งจะมีความคงที่ในทุกเซลล์ ส่วนค่าความยาวของโครโมโซมจะแตกต่างกันไปในเซลล์แต่ละเซลล์
(4) คำนวณหาค่าดัชนีเซนโทรเมียร์ (Centromeric index; CI) คำนวณได้จากสูตร ดังนี้
ค่า Centromeric index (CI) = "ความยาวของแขนโครโมโซมข้างยาว (Ll)" /"ความยาวของโครโมโซมแต่ละแท่ง (LT)"
นำค่า CI ที่ได้นำมาระบุชนิดของโครโมโซม โดยใช้เกณฑ์ดังนี้
ค่า CI อยู่ระหว่าง 0.500–0.599 จัดเป็นโครโมโซมชนิดเมทาเซนทริก
ค่า CI อยู่ระหว่าง 0.600–0.699 จัดเป็นโครโมโซมชนิดซับเมทาเซนทริก
ค่า CI อยู่ระหว่าง 0.700–0.899 จัดเป็นโครโมโซมชนิดอะโครเซนทริก
ค่า CI อยู่ระหว่าง 0.900–1.000 จัดเป็นโครโมโซมชนิดเทโลเซนทริก
(5) การจัดขนาดของโครโมโซม แบ่งออกเป็น 3 ขนาด โดยกำหนดให้โครโมโซมคู่ที่ยาวที่สุดเป็นโครโมโซมคู่ที่ 1 และโครโมโซมคู่ที่สั้นที่สุดเป็นโครโมโซมคู่สุดท้าย
โครโมโซมขนาดใหญ่ (large=L) คือ โครโมโซมที่มีความยาวมากกวาครึ่งหนึ่งของผลบวกความยาวเฉลี่ยของโครโมโซมใหญ่ที่สุด รวมกับโครโมโซมคู่เล็กที่สุด
ดังนั้น "LT เฉลี่ยคู่ที่ใหญ่สุด + LT เฉลี่ยคู่ที่เล็กสุด" /"2" ? L
โครโมโซมขนาดกลาง (medium=M) คือ โครโมโซมที่มีค่าความยาวน้อยกวาครึ่งหนึ่งของความยาวเฉลี่ยของโครโมโซมใหญ่ที่สุด รวมกับโครโมโซมคู่เล็กที่สุด
ดังนั้น "LT เฉลี่ยคู่ที่ใหญ่สุด + LT เฉลี่ยคู่ที่เล็กสุด" /"2" ? M
โครโมโซมขนาดเล็ก (small=S) ได้แก่ โครโมโซมที่มีความยาวน้อยกวาครึ่งหนึ่งของความยาวเฉลี่ยของโครโมโซมคู่ใหญ่ที่สุด
ดังนั้น "LT เฉลี่ยคู่ที่ใหญ่สุด " /"2" ? S
(6) จัดเรียงคาริโอไทป์ โดยเรียงตามชนิดของโครโมโซม แล้วค่อยเรียงตามความยาวของโครโมโซมแต่ละคู่จากมากไปหาน้อย ยกเว้นโครโมโซมเพศจะวางเป็นคู่สุดท้ายมุมล่างขวาเสมอ ต้องบอกหมายเลขของโครโมโซมแต่ละคู่ด้านล่างวางแท่งโครโมโซมให้แขนข้างสั้นอยู่ด้านบน แขนข้างยาวอยู่ด้านล่าง และนิยมวางแท่งโครโมโซมให้ตำแหน่งเซนโทรเมียร์ตรงกัน
3.7 การทำอิดิโอแกรม
อิดิโอแกรม คือ ไดอะแกรมแสดงคาริโอไทป์ของโครโมโซม 1 ชุดแฮพลอยด์ ซึ่งประกอบด้วยโครโมโซมร่างกายและโครโมโซมเพศ โดยใช้ข้อมูลค่าเฉลี่ยความยาวของโครโมโซม รูปร่างของโครโมโซม และตำแหน่งเซนโทรเมียร์ การทำอิดิโอแกรมจะทำจากเทคนิคการย้อมสีโครโมโซมแบบธรรมดาโดยใช้เซลล์ระยะเมทาเฟส ชนิดละ 20 เซลล์ นำมาจัดคาริโอไทป์ แล้ววัดความยาวของแขนโครโมโซมข้างยาว และแขนโครโมโซมข้างสั้นของโครโมโซมทุกคู่ จากนั้นนำมาจัดทำภาพวาดอิดิโอแกรม โดยนำค่าเฉลี่ยความยาวของโครโมโซม แต่ละคู่มาสร้างภาพโดยใช้โปรแกรม Microsoft Excel กำหนดให้แกนตั้ง (Y) เป็นความยาวของโครโมโซมแต่ละคู่ และแกนนอน (X) เป็นลำดับของโครโมโซมคู่ที่ใหญ่ที่สุดเรียงขนาดไปหาคู่ที่เล็กที่สุด ยกเว้นโครโมโซมเพศจัดเป็นคู่สุดท้าย แล้วนำมาปรับรูปร่างของโครโมโซมโดยใช้โปรแกรม Microsoft Word หรือ Microsoft PowerPoint
|
| คำอธิบายโครงการวิจัย (อย่างย่อ) : | - |
| จำนวนเข้าชมโครงการ : | 70 ครั้ง |
|