| รหัสโครงการ : | R000000268 |
| ชื่อโครงการ (ภาษาไทย) : | การคัดเลือกแอคติโนมัยสีทที่มีความสามารถในการควบคุมราโรคพืชเศรษฐกิจในประเทศไทย |
| ชื่อโครงการ (ภาษาอังกฤษ) : | Isolation of actinomycetes with potential application for biocontrol of Fungal plant pathogens in Thai’s crops |
| คำสำคัญของโครงการ(Keyword) : | แอคติโนมัยสีท โรคพืช |
| หน่วยงานเจ้าของโครงการ : | คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี > ภาควิชาวิทยาศาสตร์ สาขาวิชาชีววิทยา และเทคโนโลยีชีวภาพ |
| ลักษณะโครงการวิจัย : | โครงการวิจัยเดี่ยว |
| ลักษณะย่อยโครงการวิจัย : | ไม่อยู่ภายใต้แผนงานวิจัย/ชุดโครงการวิจัย |
| ประเภทโครงการ : | โครงการวิจัยใหม่ |
| สถานะของโครงการ : | propersal |
| งบประมาณที่เสนอขอ : | 400000 |
| งบประมาณทั้งโครงการ : | 400,000.00 บาท |
| วันเริ่มต้นโครงการ : | 01 มกราคม 2560 |
| วันสิ้นสุดโครงการ : | 31 ธันวาคม 2560 |
| ประเภทของโครงการ : | งานวิจัยประยุกต์ |
| กลุ่มสาขาวิชาการ : | เกษตรศาสตร์ |
| สาขาวิชาการ : | สาขาเกษตรศาสตร์และชีววิทยา |
| กลุ่มวิชาการ : | อื่นๆ |
| ลักษณะโครงการวิจัย : | ระดับชาติ |
| สะท้อนถึงการใช้ความรู้เชิงอัตลักษณ์ : | ไม่สะท้อนถึงการใช้ความรู้เชิงอัตลักษณ์ |
| สร้างความร่วมมือประหว่างประเทศ GMS : | ไม่สร้างความร่วมมือทางการวิจัยระหว่างประเทศ |
| นำไปใช้ในการพัฒนาคุณภาพการศึกษา : | ไม่นำไปใช้ประโยชน์ในการพัฒนาณภาพการศึกษา |
| เกิดจากความร่วมมือกับภาคการผลิต : | ไม่เกิดจากความร่วมมือกับภาคการผลิต |
| ความสำคัญและที่มาของปัญหา : | ความเสียหายของผลผลิตอันเนื่องมาจากโรคราในพืชเศรษฐกิจ ถือว่าเป็นปัญหาสำคัญต่อเกษตรกรไทยเป็นอย่างมาก พบว่าโรคพืชจำนวนมากมีสาเหตุมาจากจุลินทรีย์ในกลุ่มรา ตัวอย่างเช่น โรคราน้ำค้าง (Downy mildew) ที่เป็นปัญหาสำคัญกับพืชตระกูลไม้เถา เช่นแตงโม แตงกวา แตงร้าน มะระ เป็นต้น (กองส่งเสริมการอารักขาพืชและจัดการดินปุ๋ย กรมส่งเสริมการเกษตร, 2555) ซึ่งเป็นโรคที่เกิดจากราสายพันธุ์ Pseudoperonospora cubensis ในโรคใบจุดสีน้ำตาลในข้าว ซึ่งเป็นพืชเศรษฐกิจสำคัญของประเทศก็มีสาเหตุมาจากราสายพันธุ์ Helminthosporium oryzae รวมทั้งโรคกาบใบแห้งของข้าว (Rhizoctonia sheath blight) เนื่องจากราสกุล Rhizoctonia spp. โรครากและโคนเน่าในทุเรียนมีสาเหตุมาจากราสายพันธุ์ Phytophthora scinnamomi โรคกล้าเน่า (damping off) โรคเน่าคอดินในผักหลายชนิดจากราในสกุล Pythium spp. (ยุทธศักดิ์ เจียมไชยศรี, 2555) โรคเน่าคอดินในมะเขือเทศ แตงกวา หัวบีท จากรา Rhizoctonia solani (Goudjal et al. 2014) โรครากเน่าใบเน่าในผักสลัดจากรา Phytophthora parasitica Dastur และโรคใบจุดในพริกที่มีสาเหตุจากรา Cercospora oryzae จากข้อมูลดังกล่าวแสดงให้เห็นว่าราโรคพืชนั้น เป็นสาเหตุสำคัญที่ทำให้เกิดความเสียหายต่อผลผลิตทางการเกษตรเป็นจำนวนมากในแต่ละปี (นุชนารถ จงเลขา, 2546) ซึ่งในปัจจุบัน ยังไม่พบว่ามีรายงานและการศึกษาเกี่ยวกับการใช้สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่ได้จากธรรมชาติเพื่อต้านโรคพืชที่มีความจำเพาะกับโรคและใช้ครอบคลุมกับโรคพืชได้หลายชนิด ซึ่งยังเป็นสิ่งที่มีความน่าสนใจศึกษาเพื่อแก้ปัญหาเกี่ยวกับโรคพืชเศรษฐกิจ ซึ่งนับว่าเป็นปัญหาสำคัญอย่างยิ่ง นอกจากนี้ยังเป็นการลดปริมาณการใช้สารเคมีในพืชอาหารในประเทศไทยอีกด้วย โดยมีรายงานว่าพบสารสารฆ่าแมลงตกค้างในผลผลิตทางการเกษตรภายในประเทศมากมาย อาทิ คาโบฟูแรน (Carbofuran) ไดโครโตโฟส (Dicrotophos) อีพีเอ็น (EPN) และเมโทมิล (Methomyl) (รณชัย โตสมภาค อ้างถึง สุภาพร ใจการุณ และคณะ, 2555) ซึ่งนอกจากปัญหาสารเคมีตกค้างในอาหารที่ส่งผลต่อผู้บริโภคแล้ว กลุ่มเกษตรนับว่าเป็นกลุ่มบุคคลที่เสี่ยงต่อการเจ็บป่วยจากสารเคมีกำจัดศัตรูพืช เนื่องจากมีการรับสารเคมีโดยตรง และหากมีการสะสมในร่างกายในปริมาณมาก จะส่งผลกระทบอย่างร้ายแรงต่อชีวิตได้ (พิษจากสารกำจัดศัตรูพืช, 2547)
แอคติโนมัยสีทเป็นจุลินทรีย์กลุ่มหนึ่งที่น่าสนใจ เนื่องจากมีความสามารถในการสร้างสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพและสารปฎิชีวนะได้หลายชนิด (Marcia et al, 1983; Sadfi et al, 2001; El-Mehalawy et al, 2004; El-Tarabily, 2006; Errakhi et al, 2009; Gopalakrishnan et al, 2011) ตัวอย่างของแอคติโนมัยสีทกลุ่มสำคัญที่มีความสามารถสร้างสารปฏิชีวนะ ได้แก่ Streptomycetes, Actinoplanete และ Nocardioform (Okami and Hotta, 1988) โดยพบว่าสัดส่วน 2 ใน 3 ของสารปฏิชีวนะที่ใช้กันอยู่ในปัจจุบันนั้นผลิตโดยแอคติโนมัยสีท (Miyadoh, 1993) จากงานวิจัยที่ผ่านมา พบว่าแอคติโนมัยสีทในกลุ่ม Streptomyces สามารถสร้างสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพได้หลายประเภท และพบว่าสารที่ได้มีคุณสมบัติในการต้านราอย่างมีประสิทธิภาพ ตัวอย่างได้แก่ nystatin, polyoxin และ anthracycline เป็นต้น โดยเฉพาะ nystatin มีโครงสร้างเป็น polyene มีสมบัติฆ่าเชื้อราได้หลายชนิด (broad-spectrum fungicide) ส่วน polyoxin มีโครงสร้างเป็น nucleoside มีผลต่อการสร้างผนังเซลล์เชื้อรา (Macia et al., 1983)
จากงานวิจัยเกี่ยวกับความสามารถในการสร้างสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพและสารปฎิชีวนะที่กล่าวมาข้างต้น ยังพบอีกว่าแอคติโนมัยสีทหลายสายพันธุ์ มีคุณสมบัติในการยับยั้งจุลินทรีย์ก่อโรคพืชได้หลายชนิด เช่น การยับยั้งโรคเหี่ยวในต้นฝ้าย (Wilt) โดยแอคติโนมัยสีทที่คัดแยกจากรากพืช (Xue et al , 2013) การยับยั้งโรคยางไหล หรือ Gummy Stem Blight (GSB) โดยแอคติโนมัยสีทในกลุ่ม Streptomycetes spp. (Zhao et al, 2012) และกลุ่ม Actinoplanes Microbispora และ Streptomyces ที่ยับยั้งโรคเน่าคอดินในแตงกวาและมะเขือเทศ โรครากเน่าโคนเน่าในหัวบีท โรครากเน่าใน oilseed rape (El-Tarabily, 2006; Baharlouei et al, 2011; Goudjal et al, 2014) |
| จุดเด่นของโครงการ : | ในปัจจุบัน การวิจัยเกี่ยวกับการค้นหาสารต้านราโรคพืชด้วยแอคติโนมัยสีทเพื่อนำไปประยุกต์ใช้ประโยชน์ในเชิงเกษตรกรรมเพื่อเพิ่มผลผลิตทางการเกษตรยังมีไม่มากนัก จึงมีความสำคัญและน่าสนใจ และเนื่องจากประเทศไทยเป็นประเทศเกษตรกรรม มีเนื้อที่การเพาะปลูกพืชเศรษฐกิจเป็นจำนวนมาก ซึ่งพบว่ากลุ่มเกษตรกร และหน่วยงานที่ลงทุนด้านเกษตรกรรมประสบปัญหาการถูกทำลายผลผลิตทางการเกษตรจากราก่อโรคเป็นจำนวนมากในแต่ละปี ดังนั้นการควบคุมราก่อโรคพืชด้วยวิธีทางชีวภาพจึงเป็นแนวทางสำคัญที่จะแก้ไขปัญหาการสูญเสียผลผลิตทางการเกษตรอันเนื่องจากรา และยังเป็นการแก้ปัญหาสารเคมีที่ตกค้างในอาหารรวมทั้งลดความเสี่ยงต่อการรับสารเคมีกำจัดโรคพืชของเกษตรกรอีกด้วย งานวิจัยนี้จึงมุ่งเน้นการคัดแยกหาแอคติโนมัยสีทสายพันธุ์ที่สามารถยับยั้งโรคพืชที่เป็นปัญหาสำคัญได้ดีและสามารถยับยั้งโรคพืชได้หลายชนิด โดยนำมาประยุกต์เพื่อใช้เป็นสารต่อต้านโรคพืชที่เป็นปัญหาสำคัญในพืชเศรษฐกิจด้วยวิธีทางชีวภาพต่อไป |
| วัตถุประสงค์ของโครงการ : | 1. เพื่อคัดเลือกสายพันธุ์แอคติโนมัยสีทที่มีความสามารถในการควบคุมการเจริญของราโรคพืช Sclerotium rolfsii และ Rhizoctonia solani
2. จัดจำแนกสายพันธุ์แอคติโนมัยสีทที่ควบคุมราโรคพืชได้ดีที่สุดในระดับสายพันธุ์
3. เพื่อหาสูตรอาหารที่เหมาะสมในการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช
4. ศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช
5. ทดสอบความสามารถในการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืชในระดับกระถางปลูก |
| ขอบเขตของโครงการ : | 1. คัดเลือกสายพันธุ์แอคติโนมัยสีทที่มีความสามารถในการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช และจัดจำแนกสายพันธุ์ที่สามารถควบคุมโรคพืชได้ดีที่สุด ในระดับสายพันธุ์
2. คัดเลือกสายพันธุ์แอคติโนมัยสีทที่สามารถผลิตสารควบคุมโรคพืชได้ดีที่สุด มาศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตสารดังกล่าว โดยออกแบบการทดลองด้วยวิธีการทางสถิติ
3. ทำการทดสอบสารที่ผลิตโดยแอคติโนมัยสีทสายพันธุ์คัดเลือก ในการยับยั้งการเจริญของราโรคพืชในระดับกระถางปลูก |
| ผลที่คาดว่าจะได้รับ : | 1. ได้สายพันธุ์แอคติโนมัยสีทอย่างน้อย 1 สายพันธุ์ ที่มีความสามารถในการผลิตสารควบคุมราโรคพืช โดยจัดจำแนกในระดับสายพันธุ์ (species)
2. ได้สภาวะที่เหมาะสมในการผลิตสารควบคุมราโรคพืช
3. ได้สารควบคุมโรคพืช ที่เกษตรสามารถนำไปทดลองใช้เพื่อควบคุมโรคพืชได้
4. เผยแพร่ผลงานวิจัยในการประชุม/สัมมนาภายในประเทศ และ/หรือในวารสารวิชาการนานาชาติ ได้แก่ Microbiological Research, Actinomycetologica, Chiang Mai J. Sci., Antonie van Leeuwenhoek เป็นต้น |
| การทบทวนวรรณกรรม/สารสนเทศ : | ในช่วง 5 ปีที่ผ่านมา พบรายงานการคัดแยกและศึกษาเกี่ยวกับแอคติโนมัยสีทโดยมีวัตถุประสงค์เพื่อ นำไปยับยั้งจุลินทรีย์ก่อโรคต่างๆ ซึ่งสามารถแสดงได้ดังต่อไปนี้
ในปี 2009 El-Tarabily และคณะ ได้ทำการศึกษาแอคติโนมัยสีทในกลุ่มต่างๆจำนวน 29 ไอโซเลต พบว่ามี 3 สายพันธุ์ ได้แก่ Actinoplanes campanulatus, Micromonospora chalcea และ Streptomyces spiralis สามารถแสดงประสิทธิภาพการยับยั้งรา Pythium aphanidermatum ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคในแตงกวา พบว่าน้ำเลี้ยงเซลล์ของแอคติโนมัยสีทดังกล่าวมีประสิทธิภาพในการยับยั้งรา Pythium aphanidermatum ได้เป็นอย่างดีทั้งในระดับห้องปฏิบัติการและระดับเรื่อนเพาะชำในเรือนกระจก
Baharlouei และคณะในปี 2013 ได้ศึกษาแอคติโนมัยสีทในกลุ่ม Streptomyces จำนวนทั้งสิ้น 110 ไอโซเลต ที่แยกได้จากดินของประเทศอิหร่าน พบว่ามีจำนวน 18 ไอโซเลตที่แสดงผลการยับยั้งรา Sclerotinia sclerotiorum ซึ่งเป็นสาเหตุในโรครากเน่า (stem rot of oilseed rape) ใน oilseed rape ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และจากการวิเคราะห์กิจกรรมเอนไซม์ พบกิจกรรมของเอนไซม์ย่อยสลายไคติน (chitinolytic activity) ในระดับที่สูง และนอกจากนี้ยังพบว่าสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่แอคติโนมัยสีทผลิตได้ มีค่า MIC อยู่ที่ 0.781 mg mL-1
ในปี 2013 Xue และคณะ ได้ทำการศึกษาแอคติโนมัยสีทที่แยกได้จากรากพืช จำนวน 712 ไอโซเลต โดยนำมาทดสอบคุณสมบัติในการการยับยั้งรา Verticillium dahlia ซึ่งเป็นสาเหตุสำคัญในการก่อโรคเหี่ยวในต้นฝ้าย (Wilt) จากการศึกษาพบว่าแอคติโนมัยสีทที่แยกได้จำนวน 4 ไอโซเลต เป็นแอคติโนมัยสีทในกลุ่ม Streptomyces ที่สามารถยับยั้งการเจริญรวมทั้งการสร้างโคนิเดีย (Conidia) ของรา Verticillium dahlia ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และยังพบว่า ไอโซเลตดังกล่าว สามารถสร้างสารสำหรับการย่อยสลายผนังเซลล์ของราก่อโรคพืชดังกล่าวได้ เช่น ไคติเนส (Chitinase) เบต้า 1,3 กลูโคซิเดส (?-1,3- Glucosidase) เซลลูเลส (cellulase) และ โปรติเอส (protease)
Goudjal และคณะ (2014) ศึกษาการควบคุมโรคเน่าคอดินที่เกิดจาก Rhizoctonia solani และศึกษาการส่งเสริมการเจริญของมะเขือเทศโดยแอคติโนมัยสีทที่เจริญอยู่ในส่วนต่างๆ ของพืช (endophytic actinomycetes) โดยแยกแอคติโนมัยสีทจากรากของต้น Algerian Sahara จำนวน 34 สายพันธุ์ พบว่า 29 สายพันธุ์อยู่ในสกุล Streptomyces และที่เหลือ 5 สายพันธุ์ จัดเป็น non-Streptomyces จากการทดสอบเบื้องต้นพบว่าแอคติโนมัยสีท 6 สายพันธุ์ สามารถยับยั้งการเจริญของรา Rhizoctonia solani ได้ จากนั้นได้นำมาทดสอบจริง โดยใช้ดินจากไร่มะเขือเทศที่มีการติดเชื้อ Rhizoctonia solani เตรียมดินใส่ในกระถาง โดยแบ่งเป็นดินที่นึ่งฆ่าเชื้อและไม่นึ่ง เติมสารละลายเชื้อรา Rhizoctonia solani ลงไป บ่มเป็นเวลา 1 สัปดาห์ เพื่อให้ รา Rhizoctonia solani มีการเจริญก่อน จากนั้นนำเมล็ดมะเขือเทศฆ่าเชื้อ แช่ในสารละลายสปอร์ของแอคติโนมัยสีททั้ง 6 สายพันธุ์ และนำไปปลูกในกระถางที่เตรียมไว้ โดยมี 1) positive control คือ เมล็ดมะเขือเทศที่ไม่แช่สารละลายสปอร์ของแอคติโนมัยสีทปลูกในดินที่ไม่ติดเชื้อ 2) negative control คือ เมล็ดมะเขือเทศที่ไม่แช่สารละลายสปอร์ของแอคติโนมัยสีทปลูกในดินติดเชื้อ 3) เมล็ดมะเขือเทศที่แช่ในสารละลายสปอร์ของแอคติโนมัยสีททั้ง 6 สายพันธุ์ ปลูกในดินติดเชื้อ 4) เมล็ดมะเขือเทศที่แช่ใน chemical agent ปลูกในดินติดเชื้อ จากผลการทดสอบพบว่า สายพันธุ์ CA-2 ซึ่งจัดจำแนกได้เป็น Streptomyces mutabilis NBRC 1280T และ AA-2 จัดจำแนกได้เป็น Streptomyces cyaneofuscatus JCM 4364T สามารถยับยั้งการก่อโรคได้เช่นเดียวกับ chemical agent ที่ใช้ในการทดลอง
Nurkanto และ Julistiono (2014) ได้คัดแยกเชื้อแอคติโนมัยสีทที่อาศัยอยู่ในใบของต้น Syzygium aromaticum, Piper betle, Myristica fragrans หรือ Pandanus และใบพืชอื่นๆ จากเกาะ Ternate ประเทศอินโดนีเซีย เพื่อศึกษาการยับยั้งการเจริญของ Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae และ Aspergillus niger จากแอคติโนมัยสีททั้งหมด 50 สายพันธุ์ พบ 2 สายพันธุ์ คือ MC-500-1-4 ซึ่งจัดจำแนกเป็น Streptomyces misakiensis และ SR-2-2 จัดจำแนกเป็น Streptomyces tricolor มีความสามารถในการยับยั้ง S. cerevisiae ได้สูงสุด |
| ทฤษฎี สมมุติฐาน กรอบแนวความคิด : | เนื่องจากในห้องปฏิบัติการมีความพร้อมด้านทรัพยากร โดยมีแอคติโนมัยสีทที่คัดแยกจากตัวอย่างดินในธรรมชาติบริเวณจังหวัดจันทบุรี ระยองและลพบุรี จำนวน 293 สายพันธุ์ ซึ่งจากงานวิจัยที่ผ่านมา พบว่ามีความเป็นไปได้สูงที่จะพบสายพันธุ์ที่มีความสามารถในการสร้างสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพหรือสารปฎิชีวนะได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสายพันธุ์ที่สามารถผลิตสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพในกลุ่มที่มีความจำเพาะในการทำลายองค์ประกอบผนังเซลล์ของรา ดังนั้นคณะผู้วิจัยจึงสนใจที่จะนำแอคติโนมัยสีททั้งหมดมาศึกษาการผลิตสารเพื่อยับยังเชื้อราโรคพืช ซึ่งเป็นสาเหตุสำคัญที่ทำให้เกิดความเสียหายต่อผลผลิตทางการเกษตรเป็นจำนวนมากในแต่ละปี เช่น โรคเน่าคอดินในมะเขือเทศ แตงกวา หัวบีท จากเชื้อรา Rhizoctonia solani เป็นต้น |
| วิธีการดำเนินการวิจัย และสถานที่ทำการทดลอง/เก็บข้อมูล : | 1. แอคติโนมัยสีท และเชื้อราโรคพืช
1.1 แอคติโนมัยสีทที่แยกจากตัวอย่างดินจังหวัดจันทบุรี ระยอง และลพบุรี จำนวน 293 สายพันธุ์
1.2 เชื้อราโรคพืช
-โรคเน่าคอดินในมะเขือเทศที่มีสาเหตุมาจากรา Rhizoctonia salani
-โรครากเน่าโคนเน่าผักหลายชนิดที่มีสาเหตุจากรา Sclerotium rolfsii
2. การคัดเลือกสายพันธุ์แอคติโนมัยสีทที่สามารถผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช
นำเชื้อแอคติโนมัยสีทที่แยกได้จากตัวอย่างดิน จำนวน 293 ไอโซเลต มาทดสอบความสามารถในการผลิตสารควบคุมราโรคพืช โดยวิธีที่ดัดแปลงจากวิธี Dual Culture Technique (Sadfi et al., 2001) เขี่ยเชื้อแอคติโนมัยสีทที่เจริญบนอาหาร yeast extract-malt extract agar medium (ISP-2) ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 7 วัน มาขีดเป็นเส้นตรงรูปกากบาทผ่านจุดศูนย์กลางของจานบนผิวอาหารวุ้น glucose-meat extract-peptone medium (GMP) ซึ่งประกอบด้วย glucose 15 กรัม peptone 6 กรัม meat extract 3 กรัม yeast extract 3 กรัม NaCl 5 กรัม MgSO4.7H2O 0.25 กรัม วุ้น 15 กรัม และน้ำกลั่น 1000 มิลลิลิตร โดยเพาะเชื้อแอคติโนมัยสีทก่อนเพาะเชื้อราโรคพืชเป็นเวลา 5 วัน จากนั้นใช้เข็มเขี่ยเชื้อเขี่ยชิ้นวุ้นจำนวน 4 ชิ้นที่ตัดด้วย cork borrer ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 6 มม. ของเชื้อราสาเหตุโรคพืช 2 สายพันธุ์ คือ Rhizoctonia salani และ Rhizoctonia salani ที่มีอายุ 7 วัน ที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ potato dextose agar (PDA) วางลงบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อในแต่ละด้านของเชื้อแอคติโนมัยสีทที่เพาะไว้แล้ว โดยให้มีระยะห่างจากเชื้อแอคติโนมัยสีท และเชื้อราโรคพืช 2.5 เซนติเมตร บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 – 5 วัน บันทึกระยะกว้างของรัศมีโคโลนีของเชื้อราโรคพืชที่เติบโตจากจุดที่เพาะไปจนถึงขอบโคโลนีในแนวที่ถูกยับยั้ง เป็นค่า R2 และระยะกว้างของรัศมีโคโลนีจากจุดที่เพาะไปจนถึงขอบโคโลนีของเชื้อโรคพืชที่เติบโตบนอาหารเลี้ยงเชื้อ potato dextose agar เป็นเวลา 3-5 วัน เป็นค่า R1 ความสามารถในการยับยั้งการเติบโตของเชื้อราโรคพืชคำนวณโดยใช้สูตร [(R2-R1)/R1] x 100
คัดเลือกสายพันธุ์แอคติโนมัยสีทที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อราโรคพืชทั้ง 3 โดยดูจากเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง
3. การจัดจำแนกแอคติโนมัยสีทที่คัดเลือกในระดับสายพันธุ์
งานวิจัยนี้จะระบุชนิดของเชื้อที่ศึกษาจนถึงระดับสายพันธุ์ (species) โดยวิธี polyphasic taxonomic ที่ใช้กระบวนการทดสอบทั้ง 3 ด้าน ประกอบกันจนสามารถจัดจำแนกและระบุอัตลักษณ์ของจุลินทรีย์ในระดับ species ได้ ซึ่งมีต่อไปคีอ
1. สัณฐานวิทยาของจุลินทรีย์ (Morphology) ตรวจสอบด้วยการใช้ SEM และลักษณะบนจานอาหาร
2. ลักษณะทางเคมีของผนังเซลล์ ตรวจสอบจากการวิเคราะห์ชนิดของ 2,6 diaminopimelic acid (DAP test)
3. วิเคราะห์บริเวณยีน 16srRNA ที่เป็น conserve region ของแบคทีเรียทั่วไป รวมทั้งแอคติโนมัยสีท
3.1 การวิเคราะห์ชนิดของ 2,6 diaminopimelic acid ด้วยวิธี paper chromatography
การวิเคราะห์ชนิดของ 2,6 diaminopimelic acid ที่เป็นองค์ประกอบของผนังเซลล์ของแอคติโนมัยสีทที่คัดแยกได้ วิธีการทดลองได้ดัดแปลงจากวิธีของ Becker et al. (1964) และ Hasegawa et al. (1984) โดยเขี่ยเซลล์แอคติโนมัยสีทที่เจริญบนอาหาร GYE ประมาณ 1 ลูป นำใส่หลอดไมโครฟิวจ์ เติมสารละลาย 6N HCl ปริมาตร 50 ไมโครลิตร นำไปเข้า autoclave ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที นำมาปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 5,000 รอบต่อนาที ประมาณ 5-10 นาทีเพื่อแยกส่วนใสออกจากตัวเซลล์ หยดส่วนใสของเซลล์ที่ถูกย่อยด้วยกรดที่เตรียมได้ สารละลายมาตรฐาน DAP และเซลล์ที่ถูกย่อยที่ทราบชนิดของ 2,6 diaminopimelic acid ทั้งสองชนิด ลงบนแผ่น โครมาโตกราฟฟี (Whatman 3MM) จุดละ 15 ไมโครลิตร โดยใช้ปริมาณน้อยในการหยดในแต่ละครั้ง สลับกับการเป่าให้แห้งด้วยที่เป่าผม จนครบ 15 ไมโครลิตร จากนั้นนำไปแช่ในแท็งค์แก้วที่อิ่มตัวไปด้วยตัวทำละลาย mobile phase ที่ประกอบด้วย methanol : H20 : 10N HCl : pyridine ในอัตราส่วน 80 :17.5 : 2.5 : 10 เมื่อตัวทำละลายเคลื่อนขึ้นมาจนถึงขอบด้านบนของกระดาษกรองแล้ว ผึ่งให้หมาดเล็กน้อย นำมาพ่นด้วยสารละลาย 0.2 % นินไฮดรินในอะซิโตนให้ทั่วทั้งแผ่น รอให้แห้ง และนำมาอบด้วยความร้อน 100 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที บันทึกผลโดยดูจากแถบสีเขียวที่เกิดขึ้นเปรียบเทียบกับแถบของสารละลายมาตรฐาน DAP
3.2 การศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยา
3.2.1 การศึกษาสีสปอร์ สีเส้นใย และรงควัตถุที่ละลายน้ำ
เลี้ยงแอคติโนมัยสีทบนอาหาร oatmeal agar (ISP3) (Shirling and Gottlieb, 1966) สังเกตการเจริญ บันทึกสีของเส้นใยอาหาร เส้นใยอากาศ สีสปอร์ รวมทั้งสีของรงควัตถุที่ละลายน้ำที่สามารถสร้างได้ และตรวจสอบลักษณะของเส้นใยและสปอร์ของสายพันธุ์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนแบบส่องกราด (Scanning Electron Microscope, SEM)
3.2.2 การวิเคราะห์ลำดับเบสของยีน 16S rRNA gene และการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ ในสายพันธุ์ที่มีความสามารถในการยับยั้งราก่อโรคได้ดีที่สุด
วิธีสกัดดีเอ็นเอของแอคติโนมัยสีท ดัดแปลงจาก Kieser et al. (2000) เพิ่มปริมาณยีนโดยเทคนิค polymerase chain reaction (PCR) โดยใช้ไพรเมอร์ 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-‘3, M = C:A) และไพรเมอร์ 1525R (5’AAGGAGGTGWTCCARCC-‘3, W = A:T และ R =A:G ) (Lane, 1991) จากนั้นตรวจสอบปริมาณและคุณภาพผลิตภัณฑ์ PCR ด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ทำผลิตภัณฑ์ PCR ให้บริสุทธิ์และการหาลำดับเบส จากนั้นบ่งชี้สายพันธุ์แอคติโนมัยสีทจากลำดับเบสของ 16S rRNA บางส่วนและการสร้างแผนภูมิวิเคราะห์ความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการ (phylogenetics tree)
4. การคัดเลือกสูตรอาหารที่เหมาะสมที่สุดในการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช
คัดเลือกสูตรอาหารที่เหมาะสมในการผลิตสารยับยั้งการเจริญของราโรคพืช จากสูตรอาหาร 3 ชนิด ได้แก่
1. Starch-Casein agar (SCA) ประกอบด้วย soluble starch 10 กรัม casein 0.3 กรัม KNO3 2 กรัม NaCl 2 กรัม MgSO4.7H2O 0.05 กรัม CaCO3 0.02 กรัม FeSO4.7H2O 0.01 กรัม K2HPO4 2 กรัม วุ้น 18 กรัม น้ำกลั่น 1000 มิลลิลิตร พีเอช 7.0
2. Yeast extract-Malt extract agar (YM) ประกอบด้วย malt extract 3 กรัม yeast extract 3 กรัม peptone 5 กรัม glucose 10 กรัม น้ำกลั่น 1,000 มิลลิลิตร วุ?น 20 กรัม
3. Yeast extract-Malt extract agar (ISP-2) ประกอบด้วย yeast extract 4.0 กรัม malt extract 10.0 กรัม dextrose 4.0 กรัม วุ้น 15.0 กรัม และน้ำกลั่น 1000 มิลลิลิตร
โดยนำแอคติโนมัยสีทที่คัดเลือกจากข้างต้น มาเลี้ยงในอาหารทั้ง 3 ชนิด เป็นเวลา 12 วัน เก็บตัวอย่างทุกวัน และนำมาทดสอบความสามารถในการยับยั้งการเจริญของราโรคพืชทั้ง 3 ชนิด โดยวิธี agar diffusion method คัดเลือกสูตรอาหารที่ผลิตสารที่สามารถยับยั้งราโรคพืชทั้ง 3 ชนิดได้ดีที่สุด เพื่อนำไปศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อไป
5. การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืชโดยวิธีทางสถิติ
จากสูตรอาหารที่คัดเลือกจากข้างต้น นำมาศึกษาปัจจัยที่มีผลต่อการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช โดยวิธีพื้นผิวตอบสนอง ซึ่งมีจุดประสงค์เพื่อหาความสัมพันธ์ระหว่างการผลิตสารควบคุมราโรคพืชกับกลุ่มของปัจจัยที่ศึกษา ในการศึกษาครั้งนี้ได้ออกแบบการทดลองแบบ central composite design (CCD) ที่มี 3 ปัจจัย ประกอบด้วยส่วนสำคัญ 3 ส่วนคือจำนวนจุดของ factorial point มีจำนวนเท่ากับ 23 โดยแต่ละปัจจัยทั้งหมด 3 ปัจจัย จะทำการทดลอง 2 ระดับ ซึ่งใช้สัญลักษณ์ -1 แทนระดับต่ำ และ +1 แทนระดับสูง ดังนั้น การทดลองสำหรับ factorial point สามารถเขียนสัญลักษณ์ได้ดังนี้
(X1, X2, X3) = (?1, ?1, ?1)
จำนวนจุดของ center point (no) จะต้องมีการทำซ้ำมากกว่า 1 ครั้ง เพื่อคำนวณหา pure error ในการวิเคราะห์ การทดสอบความเหมาะสมของรูปแบบ การทดลองสำหรับ center point สามารถเขียนสัญลักษณ์ได้ดังนี้
(X1, X2, X3) = (0, 0, 0)
จำนวนจุดของ star point มีจำนวนเท่ากับ 2(3) โดยแต่ละจุดห่างจาก center point ด้วยระยะเท่ากันคือระยะ ? โดย เมื่อศึกษา 3 ปัจจัยจึงมีค่า ? เท่ากับ ?1.68 การทดลอง สำหรับ star point สามารถเขียนสัญลักษณ์ได้ดังนี้
(X1, X2, X3) = (?1.68, ?1.68, ?1.68)
สามารถออกแบบจำนวนชุดการทดลองได้จาก 2k + 2k + no เมื่อ k คือ จำนวนตัวแปรที่ต้องการศึกษาและ no คือ จำนวนซ้ำการทดลองที่จุดศูนย์กลาง (center point) ดังนั้นเมื่อศึกษา 3 ปัจจัย จึงเท่ากับ 23 + 2(3) + 3 สามารถออกแบบการทดลองทั้งหมด 17 การทดลอง ซึ่งแต่ละการทดลองทำซ้ำ 3 ครั้ง โดยแบ่งปัจจัยออกเป็น 5 ระดับ (-?, -1, 0, +1, + ?)
ทำการศึกษาการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืชตามแบบการทดลองที่ได้ออกแบบไว้ทั้ง 17 ทดลอง หลังจากนั้นเก็บตัวอย่าง และนำมาทดสอบความสามารถในการยับยั้งการเจริญของราโรคพืชทั้ง 3 ชนิด โดยวิธี agar diffusion method นำผลการทดลองที่ได้ไปวิเคราะห์ค่าทางสถิติโดยใช้การหาสมการการถดถอยเชิงพหุคูณเพื่อหาความสัมพันธ์ระหว่างการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืชและปัจจัยที่นำมาศึกษาโดยใช้โปรแกรม Design Expert version 7.0 และตรวจสอบความเหมาะสมของแบบจำลองโดยทดสอบการแจกแจงแบบปกติ และทดสอบความคงที่ของความแปรปรวนของความคลาดเคลื่อน และนำแบบจำลองที่ได้ไปทำนายค่าของปัจจัยที่เหมาะสมต่อการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืชโดยใช้การหาพื้นผิวตอบสนอง
6. การศึกษาผลของอุณหภูมิและพีเอชต่อการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช
ทำการศึกษาอุณหภูมิและพีเอชที่เหมาะสมสำหรับการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช โดยแอคต |
| คำอธิบายโครงการวิจัย (อย่างย่อ) : | งานวิจัยนี้ เป็นการคัดแยกหาแอคติโนมัยสีทสายพันธุ์ที่สามารถยับยั้งโรคพืชที่เป็นปัญหาสำคัญได้ดีและสามารถยับยั้งโรคพืชได้หลายชนิด โดยคัดเลือกสายพันธุ์แอคติโนมัยสีทที่มีความสามารถในการควบคุมการเจริญของราโรคพืช Sclerotium rolfsii และ Rhizoctonia solani จัดจำแนกสายพันธุ์แอคติโนมัยสีทที่ควบคุมราโรคพืชได้ดีที่สุดในระดับสายพันธุ์ จากนั้นหาสูตรอาหารรวมทั้งสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืช และทดสอบความสามารถในการผลิตสารควบคุมการเจริญของราโรคพืชในระดับกระถางปลูก |
| จำนวนเข้าชมโครงการ : | 1146 ครั้ง |