| รหัสโครงการ : | R000000256 |
| ชื่อโครงการ (ภาษาไทย) : | การเพิ่มมูลค่าและประสิทธิภาพการหมักแป้งขนมจีนโบราณจากข้าวอินทรีย์ของเชื้อแบคทีเรียผลิตกรดแล็กทิกด้วยสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัว |
| ชื่อโครงการ (ภาษาอังกฤษ) : | Value added and efficiency fermented of lactic acid bacterias on the Thai traditional organic rice vermicelli by adding lotus root extracts as a prebiotic |
| คำสำคัญของโครงการ(Keyword) : | พรีไบโอติก รากบัว แบคทีเรียกรดแล็กทิก ขนมจีนโบราณ |
| หน่วยงานเจ้าของโครงการ : | คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี > ภาควิชาวิทยาศาสตร์ สาขาวิชาชีววิทยา และเทคโนโลยีชีวภาพ |
| ลักษณะโครงการวิจัย : | โครงการวิจัยเดี่ยว |
| ลักษณะย่อยโครงการวิจัย : | ไม่อยู่ภายใต้แผนงานวิจัย/ชุดโครงการวิจัย |
| ประเภทโครงการ : | โครงการวิจัยใหม่ |
| สถานะของโครงการ : | แผนงานวิจัยหรือชุดโครงการวิจัยและโครงการวิจัยที่เสร็จสิ้นแล้ว |
| งบประมาณที่เสนอขอ : | 455400 |
| งบประมาณทั้งโครงการ : | 455,400.00 บาท |
| วันเริ่มต้นโครงการ : | 01 ตุลาคม 2559 |
| วันสิ้นสุดโครงการ : | 30 กันยายน 2560 |
| ประเภทของโครงการ : | การวิจัยและพัฒนา |
| กลุ่มสาขาวิชาการ : | วิทยาศาสตร์ธรรมชาติ |
| สาขาวิชาการ : | สาขาเกษตรศาสตร์และชีววิทยา |
| กลุ่มวิชาการ : | วิทยาศาสตร์ชีวภาพ |
| ลักษณะโครงการวิจัย : | ระดับชาติ |
| สะท้อนถึงการใช้ความรู้เชิงอัตลักษณ์ : | สะท้อนถึงการใช้ความรู้เชิงอัตลักษณ์ |
| สร้างความร่วมมือประหว่างประเทศ GMS : | ไม่สร้างความร่วมมือทางการวิจัยระหว่างประเทศ |
| นำไปใช้ในการพัฒนาคุณภาพการศึกษา : | ไม่นำไปใช้ประโยชน์ในการพัฒนาณภาพการศึกษา |
| เกิดจากความร่วมมือกับภาคการผลิต : | เกิดจากความร่วมมือกับภาคการผลิต |
| ความสำคัญและที่มาของปัญหา : | ขนมจีนจัดได้ว่าเป็นอาหารพื้นบ้านที่อยู่คู่กับสังคมไทยมาแต่โบราณ การผลิตขนมจีนส่วนใหญ่เกิดจากกรรมวิธีการหมักแป้งตามธรรมชาติ สิ่งที่ได้คือกลิ่น รส และรสชาติที่มีเอกลักษณ์เฉพาะตัว ด้วยสาเหตุของกระบวนการหมักอาศัยจุลินทรีย์ตามธรรมชาติจึงทำให้คุณภาพการผลิตแป้งหมักขนมจีนที่ได้ในแต่ละครั้งไม่คงที่ และใช้ระยะเวลานาน ถึงแม้จะมีเชื้อจุลินทรีย์ชนิดที่ทำให้เกิดการหมักที่มีคุณภาพดีก็ตาม นอกเหนือไปกว่านี้ การปนเปื้อนจากเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคก็เป็นอีกปัจจัยหนึ่งที่ต้องคำนึงถึงในการบริโภคอาหารที่เกิดจากภูมิปัญญาท้องถิ่นที่มีการควบคุมปัจจัยการผลิตที่ไม่ได้มาตรฐาน ใช้วัสดุและอุปกรณ์อย่างง่ายๆ เชื้อจุลินทรีย์จำพวกแบคทีเรียกรดแล็กทิก (Lactic Acid Bacteria; LAB) เป็นแบคทีเรียที่มีความปลอดภัยเป็นส่วนใหญ่ (GRAS = Generally Recognized As Safe) มีบทบาทสำคัญต่อการผลิตแป้งหมักขนมจีน โดยพบว่า มีปริมาณแบคทีเรียกรดแล็กทิกสูงที่สุดในระหว่างกระบวนการหมักเกือบทุกขั้นตอน และมีความสามารถในการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษจำพวก Staphylococcus aureus และ Escherichia coli ซึ่งเชื้อดังกล่าวเคยมีรายงานจากกองระบาดวิทยา กระทรวงสาธารณสุข ว่ามีสาเหตุมาจากการบริโภคขนมจีน (นิตยา, 2532) มากไปกว่านั้นแบคทีเรียกรดแล็กทิกยังมีส่วนช่วยในการสร้างสารระเหยในแป้งหมักขนมจีนอีกด้วย (จีสุดาและคณะ, 2547) สำหรับการประยุกต์ใช้ประโยชน์จากแบคทีเรียกรดแล็กทิกโดยการเติมสู่กระบวนการผลิตอาหารปลอดภัยที่เรียกกันว่าโพรไบโอทิกได้ทำกันอย่างแพร่หลาย (Shortt, 1999, Saarela et al., 2000, Mattila-Sandholm et al., 2002) หรือแม้แต่การคัดเลือกแบคทีเรียกรดแล็กทิกจากข้าวหมักเพื่อใช้เป็นกล้าเชื้อขนมจีนแป้งหมักก็ได้มีการศึกษาเพื่อพัฒนาผลิตภัณฑ์อาหารพื้นบ้านเช่นกัน (สุพรรณิการ์, 2548) การศึกษาเกี่ยวกับแบคทีเรียกรดแล็กทิกส่วนใหญ่จะเป็นการศึกษาในแง่ของการส่งเสริมกระบวนการหมักต่างๆ เพื่อดูคุณสมบัติของการเป็นเชื้อจุลินทรีย์คุณภาพดี หรือความเป็นเชื้อจุลินทรีย์โพรไบโอทิก แต่การหาสารที่ออกฤทธิ์ช่วยส่งเสริมให้เชื้อจุลินทรีย์มีคุณสมบัติเป็นเชื้อโพรไบโอทิกที่มีคุณภาพที่ดีที่เรียกว่า พรีไบโอทิก มีการศึกษากันไม่แพร่หลายนัก โดยเฉพาะสารออกฤทธิ์พรีไบโอทิกที่ได้จากพืชผักพื้นบ้านตามธรรมชาติ มีการศึกษาถึงความเป็นไปได้ของการใช้สารสกัดจากพืชธรรมชาติเป็นพรีไบโอทิกอยู่บ้าง เช่น พันธ์ระวี (2551) พบว่า สารพรีไบโอทิกที่สกัดได้จากรากบัวสามารถส่งเสริมการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกได้ดีกว่าการเจริญของเชื้อที่เลี้ยงปกติในนมหมัก
จากแนวคิดเพื่อให้การใช้ประโยชน์จากแบคทีเรียกรดแล็กทิกอย่างเต็มที่ในการมีส่วนช่วยกระบวนการหมัก จึงเป็นที่มาของงานวิจัยในการศึกษาการทำงานร่วมกันของสารพรีไบโอทิกที่สกัดได้จากรากบัว ซึ่งเป็นพืชที่หาง่ายและมีปริมาณมากในท้องถิ่น ร่วมกับคุณสมบัติการเป็นเชื้อโพรไบโอทิกของแบคทีเรียกรดแล็กทิกในกระบวนการผลิตแป้งหมักขนมจีน เพื่อประโยชน์ต่อการควบคุมมาตรฐานการผลิตอาหารพื้นบ้านปลอดภัย ลดระยะเวลาขั้นตอนการหมักแป้งขนมจีน รวมไปถึงการยกระดับการผลิตขนมจีนพื้นบ้านสู่การผลิตเชิงพาณิชย์ต่อไป |
| จุดเด่นของโครงการ : | เป็นงานวิจัยที่ใช้เทคนิคความรู้ทางวิทยาศาสตร์มาประยุกต์กับภูมิปัญญาท้องถิ่นเพื่อให้เกิดสินค้าที่มีคุณภาพ และมีความปลอดภัย เป็นที่นิยมของผู้บริโภค อีกทั้งยังร่วมสืบทอดภูมิปัญญาท้องถิ่นเพื่อให้เกิดการต่อยอดและพัฒนาผลิตภัณฑ์นำไปสู่ช่องทางการจำหน่ายที่หลากหลายมากขึ้น |
| วัตถุประสงค์ของโครงการ : | 1. เพื่อคัดแยกและจำแนกชนิดเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกจากการขั้นตอนการหมักข้าวอินทรีย์เพื่อผลิตแป้งขนมจีนโบราณ
2. เพื่อศึกษาประสิทธิภาพการหมักข้าวอินทรีย์เพื่อผลิตแป้งขนมจีนโบราณของเชื้อแบคทีเรียผลิตกรดแล็กทิกด้วยการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัว
3. เพื่อหาอัตราส่วนที่เหมาะสมของการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัวต่อการส่งเสริมประสิทธิภาพการหมักข้าวอินทรีย์เพื่อผลิตแป้งขนมจีนโบราณของเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก |
| ขอบเขตของโครงการ : | 1. กลุ่มตัวอย่าง
1.1 กลุ่มทดลอง คือ ข้าวอินทรีย์ที่ใช้ผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณที่มีเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกที่มีการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัวที่ระดับความเข้มข้นต่างกัน 4 ระดับ คือ 0, 1, 3, 5 และ 10% ตามลำดับ
1.2 กลุ่มควบคุม คือ ปริมาณเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก กระบวนการหมักข้าวอินทรีย์เพื่อผลิตแป้งขนมจีนโบราณ
2. ตัวแปรที่ศึกษา
2.1 ตัวแปรอิสระ คือ ข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณที่มีเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกและมีการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัว ได้แก่
2.1.1 ข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณที่มีการหมักตามธรรมชาติ
2.1.2 ข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณที่มีเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก 108 CFU/g แต่ไม่มีการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัว
2.1.3 ข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณที่มีเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก 108 CFU/g และมีการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัว 1 %
2.1.4 ข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณที่มีเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก 108 CFU/g และมีการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัว 3 %
2.1.5 ข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณที่มีเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก 108 CFU/g และมีการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัว 5 %
2.1.6 ข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณที่มีเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก 108 CFU/g และมีการเติมสารสกัดพรีไบโอติกจากรากบัว 10 %
2.2 ตัวแปรตาม คือ การเจริญของเชื้อแบคทีเรียผลิตกรดแล็กทิก การผลิตกรดแล็กทิก
2.3 ตัวแปรควบคุม
2.3.1 อุณหภูมิ
2.3.2 ค่า pH เริ่มต้น
2.3.3 ระยะเวลาในการหมักข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณ
2.3.4 ปริมาณการถ่ายหัวเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก
2.3.5 ปริมาณของข้าวอินทรีย์ที่ใช้เพื่อผลิตแป้งหมักขนมจีนโบราณ |
| ผลที่คาดว่าจะได้รับ : | 1. ได้เชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกทำงานร่วมกับสารพรีไบโอทิกที่สกัดจากรากบัวใช้ในกระบวนการผลิตขนมจีนโบราณ เพื่อให้ขนมจีนที่ได้มีกลิ่นรส ลักษณะเนื้อสัมผัสที่มีคุณภาพดี
2. ไดัพัฒนาเป็นขนมจีนแป้งหมักอาหารปลอดภัย ไม่มีการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรค
3. อนุรักษ์ภูมิปัญญาท้องถิ่นในการผลิตขนมจีนโบราณ และก้าวไปสู่การผลิตเชิงพาณิชย์ รวมถึงการถ่ายทอดให้กับชุมชนใกล้เคียง สร้างงาน สร้างอาชีพได้ |
| การทบทวนวรรณกรรม/สารสนเทศ : | ขนมจีนจัดได้ว่าเป็นอาหารหมักพื้นบ้านของประเทศไทยที่มีการผลิตอยู่ทั่วทุกภูมิภาคของประเทศ ซึ่งขั้นตอนและกระบวนการผลิตนั้นแตกต่างกันออกไปตามพื้นที่ แต่โดยทั่วๆ ไปประเภทของขนมจีนหลักๆ แล้วมีอยู่ด้วยกัน 2 ประเภท คือ ขนมจีนแป้งสดและขนมจีนแป้งหมัก ต่างกันตรงขั้นตอนของการทำขนมจีนแป้งหมักต้องผ่านกระบวนการหมักแป้ง จึงทำให้ขนมจีนชนิดนี้มีกลิ่นหมักเป็นเอกลักษณ์ มีความเหนียวของเส้นขนมจีน และยังเป็นที่ต้องการของผู้บริโภคอีกด้วย (สุรางค์รัตน์, 2526; ณรงค์, 2528) ปัญหาอย่างหนึ่งที่หลีกเลี่ยงไม่ได้ซึ่งมีความสำคัญต่อผู้บริโภคขนมจีนก็ คือ การปนเปื้อนจากเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อโรคในอาหาร ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคอาหารเป็นพิษ ได้แก่ Staphylococcus aureus ในระหว่างขั้นตอนการผลิต โดยมีการรายงานการเจ็บป่วยจากการบริโภคขนมจีนของกองระบาดวิทยา กระทรวงสาธารณสุขมาแล้ว (นิตยา, 2532) ด้วยสาเหตุดังกล่าวจึงต้องมีการกำหนดเกณฑ์คุณภาพมาตรฐานของขนมจีน โดยกำหนดปริมาณของเชื้อจุลินทรีย์ทั้งหมดต้องน้อยกว่า 1x106 CFU/g และต้องไม่ตรวจพบเชื้อ E. coli หรือจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรค(ลาวัณย์ และคณะ, 2546)
ด้วยเหตุที่มีการปนเปื้อนจุลินทรีย์ในทุกขั้นตอนของการผลิตขนมจีนพื้นบ้าน จึงมีความเป็นไปได้ยากที่จะควบคุมเชื้อจุลินทรีย์ดังกล่าว ตั้งแต่การหมักข้าวซึ่งถือว่าเป็นหัวใจสำคัญของการผลิตขนมจีน สามารถพบเชื้อจุลินทรีย์ในกลุ่ม แบคทีเรียกรดแล็กทิก แบคทีเรียบาซิลลัส ยีสต์และรา โดยจุลินทรีย์เหล่านี้ติดมากับวัตถุดิบนั่นเอง ส่วนของกลิ่นหมักเกิดจากกิจกรรมการเปลี่ยนสภาพทางกายภาพ และเคมีของเชื้อ Lactobacillus และ Streptococcus มีผลทำให้ค่าความเป็นกรดด่างลดลงประมาณ 4.0-3.5 เกิดการผลิตกรดแล็กทิกสูงขึ้นถึง 0.9 เปอร์เซ็นต์ ผลที่ได้ตามมาคือกลิ่นที่เป็นสารระเหยต่างๆ เช่น เอทานอล เอทิลแอซีเทต ไดแอซีทิล และกรดแอซีติก (นิตยา, 2532; จีสุดา และคณะ, 2547; ณรงค์, 2528) ระยะเวลาที่ใช้ในการหมักข้าวโดยทั่วไป ประมาณ 2-3 วัน ถ้าหมักนานกว่านี้เชื้อจุลินทรีย์สามารถย่อยสารอาหารได้มากขึ้น แต่มีผลต่อความหนืดลดลง เกิดการสะสมกรด ทำให้ขนมจีนมีกลิ่นฉุนและสีเข้นขึ้น (รักชนก, 2545) กระบวนการหมักเพื่อให้ได้ขนมจีนแป้งหมักนี้พบเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกเป็นส่วนใหญ่ ซึ่งพบปริมาณสูงอยู่ในช่วง 107 - 109 CFU/g ซึ่งสามารถสรุปได้ว่าแบคทีเรียกรดแล็กทิกเป็นกลุ่มของจุลินทรีย์ที่พบมากที่สุดในกระบวนการผลิตขนมจีนแป้งหมัก (Uchimura et. al 1998) ลำดับถัดไปจะเป็นเชื้อในกลุ่มของยีสต์ และแบคทีเรียบาซิลัส
จะเห็นได้ว่ากระบวนการผลิตขนมจีนในขั้นตอนของการหมักแป้ง จุลินทรีย์แบคทีเรียกรดแล็กทิกมีบทบาทสำคัญอย่างยิ่ง แต่กิจกรรมการเปลี่ยนแปลงของเชื้อจุลินทรีย์ดังกล่าวมีความสัมพันธ์กันกับปริมาณน้ำตาลและกรดที่เกิดขึ้นในกระบวนการหมัก ซึ่งปริมาณเชื้อจุลินทรีย์จะมีจำนวนสูงสุดในช่วง 20-24 ชั่วโมงแรก และจะค่อยลดลงตามลำดับ เนื่องมาจากการสะสมของปริมาณกรดที่เพิ่มขึ้น ท้ายที่สุดอาจจะไม่พบจุลินทรีย์บางชนิดเลย เช่น ยีสต์ (ปราโมทย์ และคณะ, 2534) การผลิตกรดแล็กทิกเนื่องมาจากการใช้น้ำตาลที่ถูกเปลี่ยนมาจากแป้งโดยจุลินทรีย์จำพวกยีสต์ ซึ่งมีประโยชน์ในการช่วยยืดอายุของขนมจีนแป้งหมัก ถือเป็นการชะลอเน่าเสียได้อีกวิธีหนึ่ง และยังทำให้ขนมจีนมีกลิ่นเป็นเอกลักษณ์เฉพาะตัวด้วย
ด้วยการเล็งเห็นถึงความสำคัญของจุลินทรีย์ชนิดแบคทีเรียกรดแล็กทิกในกระบวนการผลิตแป้งหมักขนมจีนเพื่อช่วยให้เกิดคุณลักษณะด้านต่างๆ ของขนมจีนแป้งหมักมีคุณภาพดีขึ้น ลดระยะเวลาในการหมักแป้ง รวมไปถึงการผลิตกรดแล็กทิกในแป้งหมักสามารถยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคจำพวก S. aureus, E. coli และ Coliform ได้ (สุพรรณิการ์, 2548) การที่จะส่งเสริมให้เชื้อจุลินทรีย์แบคทีเรียกรดแล็กทิกมีประสิทธิภาพการทำงานที่ดีและมีอัตราการรอดชีวิตที่สูงในระหว่างกระบวนการหมักนั้น จำเป็นต้องมีการเติมสารที่มีคุณสมบัติดังกล่าว อย่างเช่น มีการเติม crude fiber ของถั่วเขียวชนิดละเอียดจะให้อัตราการรอดชีวิตของเชื้อจุลินทรีย์แบคทีเรียกรดแล็กทิกชนิด Lactobacillus plantarum TISTR 875 ดีขึ้น (พัชรวรรณ, 2552) หรือการเติมสารพรีไบโอทิก บางจำพวก ได้แก่ อินนูลิน (Inulin) และ โอลิโก ฟรุคโตส (FOS) ซึ่งเป็นสารที่ส่งเสริมการการเจริญของเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก (Handan and Robert, 2000) หรือแม้แต่มีการใช้สารพรีไบโอทิกธรรมชาติที่สกัดได้จากรากบัว สามารถส่งเสริมการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์ Lactobacillus acidophilus ทำให้เชื้อดังกล่าวสามารถผลิตกรดแล็กทิกเพิ่มมากขึ้นเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมได้ (พันธ์ระวี, 2551)
การนำเอาความหลากหลายและการมีปริมาณมากพอของพืชท้องถิ่นมาใช้ประโยชน์ โดยเฉพาะบัวที่มีมากมายเพื่อใช้เป็นสารพรีไบโอทิกส่งเสริมการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกในขั้นตอนกระบวนการทำแป้งหมักขนมจีน ช่วยลดระยะเวลาการหมักแป้ง ควบคุมเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรค รวมถึงการยกระดับมาตรฐานการผลิตแป้งหมักขนมจีนให้ได้คุณภาพและพัฒนาจากอาหารท้องถิ่นสู่การผลิตเชิงพาณิชย์ นอกจากจะเป็นการช่วยอนุรักษ์ภูมิปัญญาท้องถิ่นในการผลิตขนมจีนโบราณแล้ว ยังคำนึงถึงความปลอดภัยของผู้บริโภค เหล่านี้จึงเป็นที่มาของโครงการวิจัยศึกษาดังกล่าว |
| ทฤษฎี สมมุติฐาน กรอบแนวความคิด : | สารพรีไบโอติกที่สกัดจากรากบัว
อัตราส่วนเหมาะสม
ส่งเสริมการเจริญเติบโต
แบคทีเรียกรดแล็กทิก
ปริมาณและ คุณภาพของแป้งหมักขนมจีนโบราณ
คุณภาพเชื้อ ลดระยะเวลาการหมักแป้ง
ควบคุมมาตรฐานการผลิตเส้นขนมจีนโปราณ
เส้นขนมจีนมีคุณภาพและปลอดภัยต่อผู้บริโภค
# เพิ่มมูลค่าขนมจีนโบราณ
# ส่งเสริมการผลิตเชิงพาณิชย์ |
| วิธีการดำเนินการวิจัย และสถานที่ทำการทดลอง/เก็บข้อมูล : | การวิเคราะห์ทางสถิติ
วางแผนการทดลองแบบ Complete Randomized Design (CRD) วิเคราะห์ความแปรปรวน (Analysis of Variance, ANOVA) และเปรียบเทียบความแตกต่างของค่าเฉลี่ยระหว่างสิ่งทดลองโดย Duncan’ s multiple range test (DMRT) ที่ระดับความเชื่อมั่น 95 เปอร์เซ็นต์
วัสดุอุปกรณ์
1. จานเพาะเชื้อ (Plate)
2. ขวดรูปชมพู่ (Flask)
3. เข็มเขี่ย
4. ตะเกียงแอลกอฮอล์
5. หลอดทดลอง
6. ปิเปต
7. ไมโครปิเปต (micropipette)
8. tip
9. กระดาษฟอยด์
10. บีกเกอร์
11. ชุดกรอง
12. โถดูดความชื้น (Desiccator)
13. เครื่องเขย่า (Shaker)
14. เครื่องชั่งแบบละเอียด (Sartorius, BP221S)
15. Vortex mixer (Scientific Industries, G-560E)
16. เครื่องวัด pH (pH meter) (Horiba, F-12)
17. Larmina air flow (Ehret, AURA-V)
18. หม้อนึ่งความดัน (Autoclave) (Hyrayama, HV-85)
19. ตู้อบ (Hot air oven)
20. เครื่อง centrifuge (SorVall RC5C Rotor GSA)
21. Ultra Sonicator (Cavitator Metter?Lectronics corp., ME11)
22. เครื่อง UV-Vis Spectrophotometer (Shimadzu, UV-160A)
23. Water bath
วัตถุดิบ
รากบัว และข้าวอินทรีย์
สารเคมี
1. 0.85% NaCl, 0.1% peptone
2. Glucose
3. Inulin
4. Oligofrucetose
5. อาหารเลี้ยงเชื้อ MRS broth
6. อาหารเลี้ยงเชื้อ MRS agar
7. Sodium oxalate
8. Sodium carbonate
9. Conc HCl
10. Carbonate-cyanide reagent
11. Ferric ammonium sulphate solution
วิธีการดำเนินงานวิจัย
1. การสกัดสารพรีไบโอติคจากรากบัว
1.1 ทำการปลอกเปลือกรากบัว ล้างให้สะอาดนำไปหั่นเป็นชิ้นบางๆ จากนั้นนำไปอบให้แห้ง บดให้ละเอียดแล้วนำผงที่ได้ไปกรองด้วยตะแกรงที่มีขนาดของรูตะแกรง 75 ไมโครเมตร
1.2 นำผงรากบัวไปสกัดด้วยน้ำกลั่นในอัตรา 1:30 และ 1:50 ที่ 85 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที
1.3 ทิ้งให้เย็น นำไปปั่นเหวี่ยงโดยเครื่อง Centrifuge ที่ 10,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที เพื่อให้ตกตะกอน
1.4 นำส่วนใสที่ได้แบ่งออกเป็น 2 ส่วน ส่วนที่หนึ่งนำไปวิเคราะห์หาปริมาณของสารพรีไบโอติคและ ส่วนที่ 2 นำไปฆ่าเชื้อเพื่อเก็บไว้ใช้ในการศึกษาอิทธิพลของสารสกัดจากรากบัวที่มีต่อการส่งเสริมการเจริญของเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิก
2. การวิเคราะห์หาสารพรีไบโอติคในสารสกัดที่ได้จากรากบัว
นำสารสกัดที่ได้จากข้อ 1 มาทำการวิเคราะห์โดยวิธีทางเคมีโดยการหาปริมาณน้ำตาลทั้งหมด (Total soluble sugar) และน้ำตาลรีดิวซ์ (Reducing Sugar) การหาปริมาณสารพรีไบโอติคแบบหยาบทำได้โดย การนำเอา (Total soluble sugar) - (Reducing Sugar)
3. การส่งเสริมการเจริญของเชื้อแบคทีเรียกรอแล็กทิกในอาหารสำเร็จ MRS ที่มีการเติมสารสกัดจากรากบัวเป็นส่วนผสม
นำสารสกัดที่สกัดได้จากรากบัวไปทำการวิเคราะห์หาปริมาณสารพรีไบโอติค อย่างหยาบแล้วเลือกอัตราส่วนที่เหมาะสมมาใช้ในการทดลองการส่งเสริมการเจริญของเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกกับสารสกัดที่ความเข้มข้นต่างๆ โดยเติมสารสกัดจากรากบัวลงในอาหารMRS 0, 1, 3, 5 และ 10% โดยใช้เชื้อเริ่มต้นที่ 2% (V/V) บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส วัดการเจริญโดยการวัด ค่า OD ที่ 550 นาโนเมตร เริ่มเก็บตัวอย่างที่ชั่วโมงที่ 0 เก็บตัวอย่างทุกๆ 3 ชั่งโมงจนถึงชั่งโมงที่ 24 และเก็บชั่วโมงที่ 48 โดยที่กลุ่มควบคุมไม่ต้องเติมสารสกัดจากรากบัว
4. การเก็บตัวอย่างเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกในกระบวนการผลิตขนมจีนแป้งหมัก
เก็บตัวอย่างจากกระบวนการผลิตขนมจีนโบราณทุกขั้นตอน เช่น ข้าวอินทรีย์หมัก น้ำหมัก แป้งนอนน้ำ แป้งทับน้ำ ขนมจีนแป้งหมัก และบริเวณพื้นที่ใกล้เคียงที่ทำการหมัก ของกลุ่มวิสาหกิจชุมชนขนมจีนโบราณ-ขนมคุ้กกี้ ครูเป้า ตำบลบางประมุง อำเภอโกรกพระ จังหวัดนครสวรรค์ ทำการเก็บตัวอย่าง 3 ซ้ำ และเก็บรักษาตัวอย่างในขวดฝาปิดสนิทที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว บรรจุลงในถังน้ำแข็ง เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
5. การวิเคราะห์เชื้อจุลินทรีย์จากตัวอย่างที่เก็บได้ในกระบวนการผลิตขนมจีนโบราณ ตามวิธีการของ BAM (2002)
5.1 การวิเคราะห์หาปริมาณเชื้อจุลินทรีย์ทั้งหมดทำได้โดย นำตัวอย่างแต่ละชนิดที่เก็บได้มาตัวอย่างละ 25 กรัม ทำการตีป่นในสารละลาย peptone water 0.1% ปริมาตร 225 มิลลิลิตร โดยใช้เครื่องตีป่นอาหาร เตรียมตัวอย่างจนได้ระดับความเจือจางที่เหมาะสม จากนั้นปิเปตสารละลายปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใส่ลงในจากเพาะเชื้อและทำการเทผสมอาหารกับตัวอย่าง (pour plate) ด้วยอาหารสูตร SPC บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ตรวจนับจำนวนโคโลนีในจานเพาะเชื้อที่อยู่ในช่วง 25-250 โคโลนี ทุกตัวอย่างทำ 3 ซ้ำ
5.2 การวิเคราะห์หาเชื้อจุลินทรีย์ชนิดแบคทีเรียกรดแล็กทิก โดยกนําตัวอย่างที่ระดับความเจือจางที่เหมาะสม เพาะเชื้อโดยวิธี pour plate ด้วยอาหารเพาะเชื้อแข็ง MRS มีการเติมโบรโมครีซอลเพอร์เพิล 0.004 เปอร์เซ็นต์ และแคลเซียมคาร์บอเนต 1 เปอร์เซ็นต์ เพื่อใช้เป็นอินดิเคเตอร์ จากนั้นปิดทับผิวหน้าอาหารเพาะเชื้อ (Overlay) ด้วยวุ้นแข็ง 1.5 เปอร์เซ็นต์ บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ศึกษาผลโดยการตรวจนับจํานวนโคโลนีแบคทีเรียกรดแล็กทิก ที่มีบริเวณใสรอบโคโลนี และเปลี่ยนสีอินดิเคเตอร์จากสีม่วงเป็นสีเหลือง ในจานเพาะเชื้อที่อยู่ในช่วง 25-250 โคโลนี การทดลองทำ 3 ซ้ำ
สูตรที่ใช้คํานวณหา ปริมาณจุลินทรีย์ทั้งหมด (CFU/g) = จํานวนโคโลนีที่นับได้ x dilution factor
6. การคัดแยกเชื้อบริสุทธิ์ของจุลินทรีย์แบคทีเรียกรดแล็กทิก
โดยเลือกโคโลนีที่เกิดที่ได้จากการทดลองในข้อ 5.2 ดูจากการเปลี่ยนสีของอินดิเคเตอร์จากสีม่วงเป็นสีเหลืองและมีบริเวณใสรอบโคโลนี ทําการขีดเชื้อ (cross streak) บนอาหารเพาะเชื้อแข็ง MRS เพื่อให้ได้เชื้อบริสุทธิ์ และตรวจสอบ ความบริสุทธิ์โดยส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ การทดลองทำ 3 ซ้ำ
7. การเก็บรักษาเชื้อบริสุทธิ์ ทำได้โดย
7.1 เชื้อบริสุทธิ์เพื่อการทดสอบ (working stock) เก็บรักษาโดยเขี่ย เชื้อบริสุทธิ์โคโลนีเดี่ยวมาแทงในหลอดอาหารเพาะเชื้อ MRS บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส และทําการต่อเชื้อทุกๆ 1 เดือน
7.2 ส่วนการเก็บรักษาเชื้อบริสุทธิ์เป็นเวลานาน จะทำการเพาะเลี้ยงในอาหารเพาะเชื้อเหลว MRS เมื่อนำไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้วเติมกลีเซอรอลปลอดเชื้อปริมาณ 15 เปอร์เซ็นต์ ผสมให้เข้ากัน เก็บที่ -20 องศาเซลเซียส และทําการต่อเชื้อทุกๆ 6 เดือน
8. การคัดเลือกเชื้อจุลินทรีย์แบคทีเรียกรดแล็กทิก โดยเลือกเชื้อที่มีคุณสมบัติในด้านการปรับปรุงกลิ่นรส ลักษณะเนื้อ สัมผัสและคุณสมบัติในการยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษ โดยทำการศึกษาดังนี้
8.1 การทดสอบความสามารถในการสร้างกรดแล็กทิก
เขี่ยเชื้อบริสุทธิ์ลงในอาหารเพาะเชื้อเหลว MRS อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง นําไปเหวี่ยงแยกเซลล์ออก จากนั้นดูดตัวอย่าง 1.0 มิลลิลิตร และเติมน้ำกลั่นที่ไล่คาร์บอนไดออกไซด์ 10 มิลลิลิตร เติมสารละลายฟีนอล์ฟทาลีนเป็นอินดิเคเตอร์ 1-2 หยด ไทเทรตด้วยสาร ละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.1 นอร์มัล จนกระทั่งถึงจุดยุติหรือเกิดการเปลี่ยนแปลงเป็นสีชมพู คํานวณ % Titratable acidity (%TA) ของกรดแล็กทิก จากสูตร (AOAC, 2000)
%TA ของกรดแล็กทิก = (N x V1 x 90.08 x 100)
1000 x V2
N = ความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด์ (นอร์มัล)
V1 = ปริมาตรของสารละลายมาตรฐานโซเดียมไฮดรอกไซด์ที่ใช้ในการไทเทรต (มิลลิลิตร)
V2 = ปริมาณของสารตัวอย่างที่ใช้ (มิลลิลิตร/กรัม)
8.2 การทดสอบความสามารถในการย่อยสตาร์ช
นำแบคทีเรียกรดแล็กทิกที่แยกได้มาขีด (streak) บนอาหารเพาะเชื้อ Starch agar บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24–72 ชั่วโมง จากนั้นใช้ lugol’s iodine หยดลงบนอาหารเพาะเชื้อ ถ้าเกิดบริเวณใสแสดงว่าเชื้อแบคทีเรียสามารถย่อยแป้งได้ ทําการวัดบริเวณใสที่เกิดขึ้นรอบๆ โคโลนี และคัดเลือกเชื้อไว้ศึกษาต่อไป (ดัดแปลงตามวิธีของ Hessentine et al., 1963 และ Sanni et al., 2002)
8.3 การทดสอบเชื้อจุลินทรีย์แบคทีเรียกรดแล็กทิกที่สามารถผลิตสารยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคได้ โดยใช้วิธี Flip streak ทำได้ดังนี้
ทำการเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกที่คัดเลือกไว้ลงบนอาหารเพาะเชื้อแข็ง Buffered-MRS โดยขีดเชื้อในลักษณะตามแนวยาวของเส้นผ่าศูนย์กลางของจานเพาะเชื้อ บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พลิกอาหารเพาะเชื้อด้านที่มีแบคทีเรียกรดแล็กทิกคว่ำลงบนฝาจานเพาะเชื้อเดิม จากนั้นนําเชื้อทดสอบ ได้แก่ Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli และ Bacillus cereus ขีดเป็นเส้นตรงบนอาหารเพาะเชื้อในแนวทางในแนวขวางกับแบคทีเรียกรด แล็กทิก นําไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ผลการศึกษาดูว่าถ้าแบคทีเรียกรดแล็กทิก สามารถสร้างสารยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียทดสอบชนิดใด แบคทีเรียทดสอบชนิดนั้นจะไม่สามารถเจริญในบริเวณใกล้แนวการเจริญของแบคทีเรียกรดแล็กทิก (Spelhaug, 1989)
9. การจำแนกชนิดของเชื้อแบคทีเรียกรดแล็กทิกในระดับสปีชีส์ ทำได้โดยนำผลการทดลองที่ได้ |
| คำอธิบายโครงการวิจัย (อย่างย่อ) : | ขนมจีนจัดได้ว่าเป็นอาหารพื้นบ้านที่อยู่คู่กับสังคมไทยมาแต่โบราณ การผลิตขนมจีนส่วนใหญ่เกิดจากกรรมวิธีการหมักแป้งตามธรรมชาติ สิ่งที่ได้คือกลิ่น รส และรสชาติที่มีเอกลักษณ์เฉพาะตัว ด้วยสาเหตุของกระบวนการหมักอาศัยจุลินทรีย์ตามธรรมชาติจึงทำให้คุณภาพการผลิตแป้งหมักขนมจีนที่ได้ในแต่ละครั้งไม่คงที่ และใช้ระยะเวลานาน ถึงแม้จะมีเชื้อจุลินทรีย์ชนิดที่ทำให้เกิดการหมักที่มีคุณภาพดีก็ตาม นอกเหนือไปกว่านี้ การปนเปื้อนจากเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคก็เป็นอีกปัจจัยหนึ่งที่ต้องคำนึงถึงในการบริโภคอาหารที่เกิดจากภูมิปัญญาท้องถิ่นที่มีการควบคุมปัจจัยการผลิตที่ไม่ได้มาตรฐาน ใช้วัสดุและอุปกรณ์อย่างง่ายๆ เชื้อจุลินทรีย์จำพวกแบคทีเรียกรดแล็กทิก (Lactic Acid Bacteria; LAB) เป็นแบคทีเรียที่มีความปลอดภัยเป็นส่วนใหญ่ (GRAS = Generally Recognized As Safe) มีบทบาทสำคัญต่อการผลิตแป้งหมักขนมจีน โดยพบว่า มีปริมาณแบคทีเรียกรดแล็กทิกสูงที่สุดในระหว่างกระบวนการหมักเกือบทุกขั้นตอน และมีความสามารถในการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษจำพวก Staphylococcus aureus และ Escherichia coli ซึ่งเชื้อดังกล่าวเ |
| จำนวนเข้าชมโครงการ : | 1123 ครั้ง |