| รหัสโครงการ : | R000000189 |
| ชื่อโครงการ (ภาษาไทย) : | การผลิตไวน์โดยใช้เส้นใยเห็ดในการหมักแทนเชื้อยีสต์ |
| ชื่อโครงการ (ภาษาอังกฤษ) : | Wine Production from mycelium of Mushroom Fermentation replace of Yeast |
| คำสำคัญของโครงการ(Keyword) : | - |
| หน่วยงานเจ้าของโครงการ : | คณะเทคโนโลยีการเกษตรและเทคโนโลยีอุตสาหกรรม |
| ลักษณะโครงการวิจัย : | โครงการวิจัยเดี่ยว |
| ลักษณะย่อยโครงการวิจัย : | ไม่อยู่ภายใต้แผนงานวิจัย/ชุดโครงการวิจัย |
| ประเภทโครงการ : | โครงการวิจัยใหม่ |
| สถานะของโครงการ : | propersal |
| งบประมาณที่เสนอขอ : | 340000 |
| งบประมาณทั้งโครงการ : | 340,000.00 บาท |
| วันเริ่มต้นโครงการ : | 13 มกราคม 2557 |
| วันสิ้นสุดโครงการ : | 12 มกราคม 2558 |
| ประเภทของโครงการ : | งานวิจัยประยุกต์ |
| กลุ่มสาขาวิชาการ : | วิทยาศาสตร์ธรรมชาติ |
| สาขาวิชาการ : | ด้านวิทยาศาสตร์ เทคโนโลยีและอุตสาหกรรม |
| กลุ่มวิชาการ : | อื่นๆ |
| ลักษณะโครงการวิจัย : | ระดับชาติ |
| สะท้อนถึงการใช้ความรู้เชิงอัตลักษณ์ : | สะท้อนถึงการใช้ความรู้เชิงอัตลักษณ์ |
| สร้างความร่วมมือประหว่างประเทศ GMS : | ไม่สร้างความร่วมมือทางการวิจัยระหว่างประเทศ |
| นำไปใช้ในการพัฒนาคุณภาพการศึกษา : | ไม่นำไปใช้ประโยชน์ในการพัฒนาณภาพการศึกษา |
| เกิดจากความร่วมมือกับภาคการผลิต : | ไม่เกิดจากความร่วมมือกับภาคการผลิต |
| ความสำคัญและที่มาของปัญหา : | ในปัจจุบันไวน์ (wine) จัดเป็นเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ชนิดหนึ่งที่ได้รับความนิยมอย่างแพร่หลาย เนื่องจากกระแสความนิยมจากประเทศตะวันตก หรือการคำนึงถึงประโยชน์ในแง่ของการบำรุงสุขภาพ ไวน์มีต้นกำเนิดในศตวรรษที่ 19 เมื่อหลุยส์ ปาสเตอร์ นักวิทยาศาสตร์คนดังของโลกพบว่า ยีสต์ เป็นตัวเปลี่ยนน้ำตาลในผลไม้เป็นแอลกอฮอล์ โดยอาศัยปฎิกิริยาที่ค่อนข้างซับซ้อน ยีสต์โดยเฉพาะ Saccharomyces cerevisiae สามารถที่จะผลิตเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนส (Alcohol dehydrogenase ; ADH) เพื่อเปลี่ยนอะซิตัลดีไฮด์ (acetaldehyde) ไปเป็นแอลกอฮอล์ ไวน์จะต่างจากเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ชนิดอื่นๆ ตรงที่วัตถุดิบที่ใช้ในการผลิต ไวน์ผลิตได้จากการหมักขององุ่น ทำให้มีรสเปรี้ยว รสหวาน และมีกลิ่นหอมขององุ่น มีปริมาณแอลกอฮอล์ไม่สูงมาก และในกระบวนการผลิตไวน์เมื่อสิ้นสุดการหมักจะไม่มีการกลั่นและไม่มีการเจือปนรสหรือกลิ่น (Soleas, Diamandis and Goldberg. 1997 : 287-313) ไวน์มีประโยชน์ต่อร่างกายมากกว่าเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ชนิดอื่นๆ เพราะไวน์ให้ทั้งแคลอรี่ และวิตามิน นอกจากนี้ไวน์ยังเป็นสิ่งที่ช่วยให้เจริญอาหาร ทำให้บริโภคอาหารได้มากขึ้น ไวน์สามารถดื่มได้ทั้งชายและหญิง เนื่องจากมีปริมาณแอลกอฮอล์ในไวน์ไม่สูงหรือต่ำเกินไป โดยปกติไวน์จะมีแอลกอฮอล์อยู่ประมาณ 8-12 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งปริมาณแอลกอฮอล์ในไวน์สามารถที่จะยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่เป็นโทษต่อร่างกายได้ ดังนั้นไวน์จึงเป็นเครื่องดื่มที่ปลอดภัยจากการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ แต่อย่างไรก็ตามไวน์ก็เป็นเครื่องดื่มประเภทแอลกอฮอล์ซึ่งประเด็นสำคัญในเรื่องแอลกอฮอล์คือปริมาณ ถ้าดื่มเกินระดับพอดีย่อมก่อให้เกิดอันตรายในหลายรูปแบบต่างๆ แต่หากดื่มในปริมาณที่เหมาะสมประมาณ 240 ml/วัน ก่อนหรือหลังอาหารกลับจะเป็นประโยชน์ต่อร่างกาย นอกจากนี้ในทางการแพทย์ยังใช้ไวน์เพื่อรักษาโรคหรือความเจ็บป่วยบางชนิด โดยมีแพทย์ใช้ไวน์เป็นอาหารบำบัดความเจ็บป่วยเล็กๆ น้อยๆ ใช้เป็นยาระงับความตื่นเต้นหรือความกังวล ช่วยควบคุมระดับคอเลสเตอรอลที่ดี และที่ไม่ดีต่อร่างกาย (HDL-LDL cholesterol) ให้อยู่ในอัตราส่วนที่สมดุลดีขึ้น ช่วยป้องกันโรคหัวใจ ช่วยให้การขับถ่ายปัสสาวะสะดวก เป็นอาหารเสริมสำหรับผู้เป็นโรคเบาหวาน เป็นต้น (สามารถ พรหมศิริ. 2533 : 6-7 ; McArthur, Hogan and Isenberg. 1982 : 199-203)
เมื่อไม่นานมานี้มีการค้นพบว่าเห็ดบางชนิดสามารถผลิตเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนสได้ เช่น เห็ดนางรม (Pleurotus ostreatus), เห็ดเข็มเงิน-เข็มทอง (Flammulina velutipes), เห็ดเห็ดมัสซึตาเกะ (Tricoloma matsutake) และเห็ดแชมปิญอง (Agaricus blazei) (Okamura and others. 2001 : 1596-1600; 2003 : 133-144) ซึ่งเห็ดเป็นอาหารจากธรรมชาติชนิดหนึ่งที่มนุษย์มักจะนำไปใช้ในการประกอบอาหารกันมากและหาได้ง่ายตามท้องถิ่น กล่าวกันว่าดอกเห็ดอุดมไปด้วยโปรตีน แร่ธาตุ และวิตามิน และสารสำคัญทางยาหลายชนิดเช่น สาร Polysaccharide of pentose (1-3)-?-D-glucan ที่ช่วยในการต้านสารที่ก่อให้เกิดมะเร็ง หรือสาร Eritadenine ที่สามารถป้องกันโรคเส้นเลือดตีบได้ ( เกศศินี ตระกูลทิวากร. 2543 : 164-176 ; อนงค์ จันทร์ศรีกุล. 2530 : 1-2) เห็ดเศรษฐกิจที่สำคัญในประเทศไทยมีอยู่หลายชนิดเช่น เห็ดนางรม เห็ดนางฟ้า เห็ดภูฐาน เห็ดหอม เห็ดขอนขาว เห็ดกระด้าง เห็ดนางรมฮังการี เห็ดหูหนู เห็ดแครงและเห็ดหลินจือ เป็นต้น ซึ่งเห็ดเหล่านี้สามารถทำการเพาะเลี้ยงให้เกิดดอกได้ง่ายทั่วภูมิภาคของประเทศไทยรวมทั้งในจังหวัดนครสวรรค์
การนำเห็ดกินได้มาใช้ในการหมักไวน์ คาดว่าไวน์ที่ได้จะมีผลในการต้านสารที่ก่อให้เกิดโรคมะเร็งและโรคเส้นเลือดตีบ หรือการแข็งตัวของเลือดในกระแสโลหิตได้ นอกจากนี้ยังช่วยลดคอเลสเตอรอลและกลูโคสในเลือด เพิ่มการทำหน้าที่ของเม็ดโลหิตขาว (magcrophage) และช่วยกระตุ้นการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันของร่างกาย เช่นเดียวกับพวกอาหารเสริมอื่นๆ ที่ทำให้สุขภาพดีและแข็งแรง ถือเป็นอีกทางเลือกที่มีประโยชน์ในการผลิตไวน์โดยเปลี่ยนมาใช้เส้นใยเห็ดแทนเชื้อยีสต์ ซึ่งคาดว่าในอนาคต เมื่อพัฒนาให้ออกมาในเชิงอุตสาหกรรม จะมีคนหันมาดื่มไวน์ที่ผลิตจากเห็ดที่ช่วยเสริมสุขภาพมากขึ้น (Okamura and others. 2001 : 1596-1600 ; Manzi and Laura. 2000 : 315-318)
งานวิจัยนี้จึงทำการศึกษาถึงความสามารถในการผลิตเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนสของเห็ด โดยคัดเลือกเห็ด 2 ชนิดที่สนใจคือ เห็ดนางฟ้า และเห็ดแครง เพื่อนำเอาเส้นใยเห็ดเหล่านี้มาใช้ในการผลิตไวน์ รวมทั้งวิเคราะห์หากิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant activity) ในไวน์ที่ผลิตได้ เพื่อเป็นข้อมูลในการศึกษาและพัฒนาต่อไป |
| จุดเด่นของโครงการ : | - |
| วัตถุประสงค์ของโครงการ : | 1. เพื่อศึกษาความสามารถในการผลิตเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนสของเห็ด 2 ชนิดคือ เห็ดนางฟ้า และเห็ดแครง
2. เพื่อศึกษาถึงความสามารถในการหมักไวน์โดยใช้เส้นใยเห็ดนางฟ้า และเห็ดแครง
3. เพื่อวิเคราะห์หาประสิทธิภาพในกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant activity) ของไวน์ที่ผลิตได้จากเห็ดนางฟ้า และเห็ดแครง |
| ขอบเขตของโครงการ : | 1. เพาะเลี้ยงเห็ดนางฟ้าและเห็ดแครงในอาหารแข็ง (PDA) เพื่อเก็บไว้เป็นหัวเชื้อในการผลิตเส้นใยเห็ด
2. เพาะเลี้ยงเส้นใยเห็ดนางฟ้าและเห็ดแครงในอาหารเหลว
3. นำเส้นใยเห็ดนางฟ้าและเห็ดแครงที่เลี้ยงได้ในอาหารเหลวไปวิเคราะห์หาเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนส
4. นำเส้นใยเห็ดนางฟ้าและเห็ดแครงที่เลี้ยงได้มาใช้ในการหมักไวน์แล้ววิเคราะห์ปริมาณแอลกอฮอล์ และกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant activity assays) ในไวน์ที่ผลิตได้ |
| ผลที่คาดว่าจะได้รับ : | 1. ทราบข้อมูลเกี่ยวกับเห็ดนางฟ้าและเห็ดแครงที่มีความสามารถในการผลิตเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนส เพื่อใช้เป็นข้อมูลในการนำเส้นใยเห็ดไปใช้ในการหมักไวน์
2. ทราบถึงความสามารถในกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant activity) ของไวน์ที่ผลิตได้
3. นำผลการวิจัยไปพัฒนาต่อยอดในการผลิตไวน์สุขภาพเชิงพาณิชย์ในระดับอุตสาหกรรม ทั้งในภาครัฐและภาคเอกชน |
| การทบทวนวรรณกรรม/สารสนเทศ : | เกศศินี ตระกูลทิวากร (2543 : 164-176) จากการคำนวณปริมาณสารที่มีฤทธิ์ต้านสารอนุมูลอิสระและการกำหนดศักยภาพของผักโดยใช้วิธีของ Tsushida et al. (1994) พบว่าเห็ดตีนแรดมีศักยภาพในการต้านสารอนุมูลอิสระในระดับสูงมากเมื่อเปรียบเทียบต่อน้ำหนักสด 100 กรัม ในเห็ดแครง พบสารพวกโพลีแซคคาไรด์ที่มีคุณสมบัติยับยั้งการเจริญของเนื้องอก ยังพบคุณสมบัตินี้ในสารโพลีแซคคาไรด์ในเห็ด shiitake (เห็ดหอม) และสามารถสกัดสาร eritadenine ในเห็ดหอมซึ่งสามารถลดระดับโคเลสเตอรอลในหนู (rat) ที่น่าสนใจคือเห็ดที่พบในประเทศไทยอาจมีโอกาสพบสารที่มีคุณประโยชน์ด้านสุขภาพเหล่านี้ด้วย
วสันณ์ เพชรรัตน์ (2542 : 261-269) จากการรายงานวิเคราะห์เห็ดแครงพบว่าเห็ดแครงมีกรดอะมิโนที่มีประโยชน์ต่อร่างกายหลายชนิด ได้แก่ คีสทีน (cystine) กลูตามีน (glutamine) นอกจากนี้ก็มีพวกโพลีแซคคาไรด์ (polysaccharide) ที่มีชื่อว่า Shizophyllan (? 1-33-glucan) เป็นจำนวนมาก สารShizophyllan ที่พบในเห็ดแครงสามารถต่อต้านการเจริญของเซลล์มะเร็งหลายชนิด ได้แก่ sarcoma 180 ,sarcoma 37 และ Ehrlich carcinoma สามารถป้องกันการเข้าทำลายของเชื้อแบคทีเรียหลายชนิดในหนูทดลอง เช่น Psudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Escherichia coli และ Klebsiella pneumonia เป็นต้น มีการรักษาคนไข้ที่เป็นโรคมะเร็งในระบบทางเดินอาหารจำนวน 367 คน พบว่าคนไข้ที่ได้รับสาร Shizophyllan ร่วมกับยา (chemotherapy) คนไข้จะมีชีวิตยืนกว่าพวกที่รักษาโดยใช้ยาอย่างเดียว และเมื่อใช้สาร Shizophyllan รักษาโรคมะเร็งปากมดลูกร่วมกับฉายรังสีพบว่าคนไข้มีอายุยืนกว่ารักษาด้วยฉายรังสีถึง 5 ปี
Manzi and Laura (2000 : 315-318) ศึกษาการวิเคราะห์ ?-glucan โดยการดัดแปลงวิธีทางเอนไซม์ (modification of enzymatic method) ที่พัฒนาจากวิธีที่ใช้ในการวิเคราะห์พวกธัญพืช แล้วทำการทดสอบด้วยวิธีทาง spectrophotometric ซึ่งเห็ดหลายชนิดที่นำมาศึกษาพบว่า มีความเข้มข้นของเบต้ากลูแคน ตั้งแต่ 0.21-0.53 g/100 g (dry basis) และ ในเห็ดแต่ละชนิดจะมีปริมาณของเบต้ากลูแคนแตกต่างกันซึ่งจะกระจายอยู่ในส่วนของเส้นใยอาหาร (dietary fiber)ทั้งที่เป็น soluble และ insoluble dietary fibre
Okamura และคณะ (2001 : 1596-1600) ศึกษาพบว่าเห็ดบางชนิดสามารถผลิตเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนสได้และใช้ในการหมักไวน์แทนยีสต์ โดยการผลิตไวน์ด้วยเส้นใยเห็ด Pleurotus ostreatus พบว่าได้ความเข้มข้นของแอลกอฮอล์อยู่ 2.6 M หรือประมาณ12.2 % ในกรณีของการใช้เห็ด Agaricus blazei ในการผลิตไวน์ได้ความเข้มข้นของแอลกอฮอล์ 1.7 M หรือประมาณ 8 % ซึ่งผลิตได้ทั้งในสภาวะที่ใช้ออกซิเจนและไม่ใช้ออกซิเจน ผลผลิตของไวน์ที่ได้จาก A. blazei จะประกอบด้วยน้ำตาลพวก ?-D-glucan เป็นองค์ประกอบอยู่ 0.68% ซึ่งน้ำตาลนี้มีคุณสมบัติในการป้องกันมะเร็ง ส่วนไวน์ที่ใช้เห็ด Flammulina velutipes ในการหมักไวน์จะทำให้มีสารที่สามารถป้องกันเส้นเลือดตีบ ที่ช่วยยืดระยะเวลาการแข็งตัวของเลือดได้นานขึ้นเป็น 2.2 เท่า ดังนั้นไวน์ที่ผลิตจากเห็ดจึงคาดว่ามีคุณสมบัติในการต้านสารก่อมะเร็งและโรคเส้นเลือดตีบได้
Okamura และคณะ (2003 : 133-144) มีการศึกษาพบว่าเห็ดบางชนิดสามารถผลิตเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนสและสามารถนำไปใช้ในการทำไวน์, เบียร์และสาเกแทนเชื้อ S. cerevisiae โดยการผลิตไวน์ด้วยเส้นใยเห็ด Pleurotus ostreatus พบว่าได้ความเข้มข้นของแอลกอฮอล์สูงสุดคือ 2,648 mM หรือประมาณ 12.2% รองลงมาคือ 1,736 mM (8.0%) โดยใช้เส้นใยเห็ด Agaricus blazei ซึ่งสามารถผลิตได้ทั้งในสภาวะที่ใช้ออกซิเจนและไม่ใช้ออกซิเจน ในกรณีการผลิตเบียร์ด้วยเส้นใยเห็ด Tricoloma matsutake พบว่าได้ความเข้มข้นของแอลกอฮอล์สูงสุดคือ 1,069 mM (4.6%) และการผลิตสาเกด้วยเส้นใยเห็ด Agaricus blazei ได้ความเข้มข้นของแอลกอฮอล์สูงสุดคือ 1,736 mM (8.0%) และพบว่าผลผลิตไวน์ที่ได้จาก Agaricus blazei ประกอบด้วยน้ำตาลพวก ?-D-glucan เป็นองค์ประกอบอยู่ 0.68% ในเบียร์ที่ได้จาก Tricoloma matsutake มี ?-D-glucan เป็นองค์ประกอบ 0.17% และสาเกที่ได้จาก Agaricus blazei จะมี ?-D-glucan เป็นองค์ประกอบอยู่ 0.03% ซึ่งมีรายงานว่าสารนี้มีคุณสมบัติในการต้านสารก่อมะเร็ง ดังนั้นเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ที่ผลิตได้จากเส้นใยเห็ดคาดว่าจะมีประโยชน์ต่อสุขภาพในการต้านสารก่อมะเร็งได้
Solomon (2003 : 3) ได้ศึกษาถึงคุณสมบัติทางยาของเห็ดพบว่าส่วนของ fruit bodies ของดอกเห็ดที่มีสารโพลีแซคคาไรด์เป็นองค์ประกอบ โดยทำการเลี้ยงให้ได้เส้นใย (mycelium) และเลี้ยงในอาหารเหลว ส่วนประกอบหลักของโพลีแซคคาไรด์คือ ?-D-glucan สามารถต่อต้านการเจริญของเซลล์มะเร็งได้ สารโพลีแซคคาไรด์ที่ใช้เป็นยาที่พบในเห็ดหลายชนิด เช่น Agaricus brasiliensis, Phellinus lentinus, Grifora frondosa, Tremella mesenterrica, Hypsizigus marmoreus, Flammulina velutipes ซึ่งให้ผลที่ดีทั้งสิ้น สารโพลีแซคคาไรด์ที่ได้จากเห็ดไม่ได้เข้าทำลายเซลล์มะเร็งโดยตรง แต่ทำเกิดผลกระทบต่อการเจริญของเซลล์มะเร็งและช่วยให้ผู้ป่วยสามารถสร้างภูมิคุ้มกันขึ้นได้ |
| ทฤษฎี สมมุติฐาน กรอบแนวความคิด : | สมมติฐานของการวิจัย
1. เส้นใยของเห็ดนางฟ้าและเห็ดแครง มีความสามารถในการผลิตเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนสได้
2. เส้นใยของเห็ดนางฟ้าและเห็ดแครงนั้นมีศักยภาพในการผลิตไวน์ได้
3. คาดว่าไวน์ที่ผลิตได้มีความสามารถต้านอนุมูลอิสระได้ (Antioxidant activity) |
| วิธีการดำเนินการวิจัย และสถานที่ทำการทดลอง/เก็บข้อมูล : | รูปแบบการวิจัย
ในการวิจัยนี้ออกแบบการทดลองแบบแฟคทอเรียล (Factorial) มีการวางแผนการทดลองแบบสุ่มในบล็อกแบบสมบูรณ์ (Randomized Complete Block Design, RCBD) โดยทำการทดลอง 3 ซ้ำ
วัสดุอุปกรณ์
1. จานเพาะเชื้อ (Plate)
2. ขวดรูปชมพู่ (Flask)
3. เข็มเขี่ย
4. ตะเกียงแอลกอฮอล์
5. หลอดทดลอง
6. เม็ดบีท
7. คอกบอยเลอร์ (Cork borer) ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 1 cm (เบอร์ 9)
8. ปิเปต
9. ไมโครปิเปต (micropipette)
10. tip
11. กระดาษฟอยด์
12. บีกเกอร์
13. ชุดกรอง
14. โถดูดความชื้น (Desiccator)
15. เครื่องเขย่า (Shaker)
16. เครื่องชั่งแบบละเอียด (Sartorius, BP221S)
17. Vortex mixer (Scientific Industries, G-560E)
18. เครื่องวัด pH (pH meter) (Horiba, F-12)
19. Larmina air flow (Ehret, AURA-V)
20. หม้อนึ่งความดัน (Autoclave) (Hyrayama, HV-85)
21. ตู้อบ (Hot air oven)
22. เครื่อง centrifuge
23. Ultra Sonicator (Cavitator Metter?Lectronics corp., ME11)
24. เครื่อง UV-Vis Spectrophotometer (Shimadzu, UV-160A)
25. gas chromatography (Shimadzu model GC-14A)
26. อาหารเลี้ยงเชื้อ Potato dextrose agar (PDA)
27. อาหารเลี้ยงเชื้อ Potato dextrose broth (PDB)
28. Malt extract
29. Somogyi-Nelson และสารเคมีอื่นๆ
วิธีดำเนินการทดลอง
1. เพาะเลี้ยงเห็ดแต่ละชนิดในอาหารแข็ง
ทำการเพาะเลี้ยงเชื้อเห็ดนางฟ้า และเห็ดแครงในอาหารแข็ง (Potato dextrose agar ; PDA) เพื่อเก็บไว้เป็นหัวเชื้อในการผลิตเส้นใยเห็ด (Park and others. 2001 : 76-81) โดยนำเส้นใยเห็ดเห็ดนางฟ้า และเห็ดแครงที่ได้รับมาจากศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (ไบโอเทค) นำมาเลี้ยงในอาหารแข็ง โดยใช้เข็มเขี่ยเชื้อตัดส่วนของเส้นใยเห็ดเริ่มต้นแต่ละชนิดที่เจริญจนเต็มหลอดเลี้ยงเชื้อ (slant) ให้มีขนาดประมาณ 1.5 ? 1.5 cm นำไปวางลงบนอาหารแข็งในจานเพาะเลี้ยงใหม่ที่จะใช้เตรียมเส้นใยเห็ด โดยวางในลักษณะที่คว่ำด้านที่เส้นใยเจริญลงบนอาหารตรงกลางจานเพาะเลี้ยง นำจานเพาะเลี้ยงที่ต่อเส้นใยเห็ดใหม่แล้วไปวางเลี้ยงประมาณ 2 วัน โดยที่ยังไม่คว่ำจานเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิห้อง เมื่อครบกำหนด 2 วัน จึงมาคว่ำจานเพาะเลี้ยง รอให้เส้นใยเห็ดเจริญจนเต็มจานเพาะเลี้ยง โดยจะใช้เวลาประมาณ 1-2 สัปดาห์ จึงนำไปใช้ต่อไปหรือเก็บไว้ในตู้เย็น
2. เพาะเลี้ยงเส้นใยเห็ดแต่ละชนิดในอาหารเหลว
ทำการเพาะเลี้ยงเส้นใยเห็ดแต่ละชนิดที่เตรียมได้จากข้อ 1 ลงในฟลาสก์ขนาด 200 ml ซึ่งบรรจุอาหารเหลว (Potato dextrose broth ; PDB) ที่มีการเติม malt extract 2% ที่อุณหภูมิห้อง และมีการใส่เม็ดบีด (bead) ลงไปในฟลาสก์ด้วย เพื่อที่จะช่วยในการกระจายตัวของเส้นใยเห็ด จากนั้นนำ ฟลาสก์ที่มีอาหารไปทำการนึ่งฆ่าเชื้อ (Autoclave) ที่อุณหภูมิ 121?C ความดัน 15 ปอนด์/ ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที ทำการถ่ายเชื้อเห็ดทั้งสองชนิดโดยใช้คอกบอยเลอร์เบอร์ 3 กดเส้นใยที่เจริญอยู่ในจานเพาะเลี้ยงลงในฟลาสก์ ในปริมาณของชิ้นวุ้น 2 ชิ้นของคอกบอยเลอร์เบอร์ 3 ต่ออาหาร 40 ml โดยทำในสภาวะปลอดเชื้อ (Aseptic technique) จากนั้นนำไปเลี้ยงบนเครื่องเขย่า (Shaker) ที่ความเร็วรอบ 150 rpm ที่อุณหภูมิห้อง เมื่อครบ 7 วัน เก็บเกี่ยวเส้นใยเห็ดมาวิเคราะห์หาน้ำหนักแห้งของเซลล์โดยนำเส้นใยเห็ดมากรองด้วยกรวยบุชเนอร์ ซึ่งใช้กระดาษกรองเบอร์ 2 ที่อบจนน้ำหนักแห้งคงที่และทราบค่า ล้างเซลล์ด้วยน้ำกลั่น 3 ครั้ง นำเข้าตู้อบ (Hot air oven) ที่อุณหภูมิ 80-90?C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หรือจนได้น้ำหนักคงที่ จากนั้นนำออกจากตู้อบไปวางไว้ในโถดูดความชื้น (desicator) ทิ้งไว้ให้เย็นแล้วนำมาชั่งหาน้ำหนัก ผลต่างของน้ำหนักแห้งที่ได้ทั้งสองครั้ง นำมาคำนวณหาน้ำหนักแห้งของเซลล์ รายงานผลเป็นกรัมต่อลิตร
3. นำเส้นใยเห็ดที่เลี้ยงได้ในอาหารเหลวไปวิเคราะห์หาเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนส
ทำการสกัดเซลล์ (cell extract) จากเส้นใยเห็ดแต่ละชนิด โดยนำเส้นใยเห็ดที่เพาะเลี้ยงได้ในอาหารเหลวมาทำการปั่นเหวี่ยง (centrifuge) ที่ความเร็วรอบ 10,000 rpm อุณหภูมิ 6-8 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นเทส่วนใสทิ้งและล้างเส้นใยด้วยสารโซเดียมคลอไรด์ 0.9% 2 ครั้ง โดยแต่ละครั้งจะต้องเขย่าก่อนแล้วจึงทำการปั่นเหวี่ยงที่ 10,000 rpm ที่อุณหภูมิ 6-8?C เป็นเวลา 10 นาที ครั้งสุดท้ายหลังจากที่ปั่นเหวี่ยงแล้วเทส่วนใสทิ้งจะเหลือเฉพาะเส้นใยเห็ด หากพบว่าเส้นใยที่เกาะตัวกันมีขนาดเล็กให้ใช้ช้อนสแตนเลสที่ปลอดเชื้อคนในหลอดปั่นเหวี่ยง หรือถ้าเส้นใยมีขนาดใหญ่มากให้ใช้มีดที่ฆ่าเชื้อแล้วตัดเป็นชิ้นเล็กๆ โดยเทเส้นใยเห็ดลงบนจานปลอดเชื้อ จากนั้นนำเส้นใยเห็ดใส่ในหลอดปั่นเหวี่ยงอันเดิม เติม 100 ml ของ 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) ปิดฝาหลอดให้แน่นจากนั้นนำไปเข้าเครื่อง Ultrasonic oscillator (Branson, Sonifier 250) เป็นเวลา 30 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ทำการกรองเพื่อแยกส่วนใสหรือที่เรียกว่า cell-free extract เก็บไว้เพื่อใช้ในการวิเคราะห์หาเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนส (Okamura and others. 2001 : 1596-1600) ทำได้โดยเติมสารละลายเอทานอล ความเข้มข้น 800 ?mol ปริมาตร 750 ?l ลงใน cuvette ที่จะใช้วัดค่าการดูดกลืนแสง เติมสารละลาย Tris-HCl buffer pH 7.5 ความเข้มข้น 10 mM ปริมาตร 60 ?l จากนั้นเติมน้ำสกัดจากเส้นใยเห็ดที่เพาะเลี้ยงในอาหารเหลว (cell-free extract) ปริมาตร 1991 ?l สำหรับ Blank ที่ใช้ในการวัดเทียบจะเติมน้ำกลั่นที่ผ่านการต้มเพื่อกำจัดออกซิเจนแทน cell free extract จากนั้นเติม NAD+ ความเข้มข้น 15.074 ?mol ปริมาตร 199 ?l และเริ่มจับเวลาทันทีพร้อมทั้งปิดฝาหลอดทดลอง เขย่าให้เป็นเนื้อเดียวกัน เมื่อครบเวลาตามที่กำหนดจึงนำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 340 nm โดยใช้เวลาที่ 0,1,2,3 และ 4 นาที ซึ่งในขณะที่รอให้ครบเวลาให้นำหลอดทดลองไปบ่มที่อุณหภูมิ 30?C แล้วนำผลค่าการดูดกลืนแสงที่ได้จากการวัดที่ความยาวคลื่น 340 nm ไปคำนวณหาค่า Specific activity ของเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนสได้โดยใช้สูตรในการคำนวณคือ
C = V ? MW ? ?A (g/l)
? ? d ?v
เมื่อแทนค่าต่างๆ ลงในสูตรจะทำให้ทราบความเข้มข้นของ NADH ที่เกิดขึ้นจากการทำปฏิกิริยาของเอนไซม์ แล้วนำค่าที่ได้ไปคำนวณหาค่า Specific activity ของเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนส เมื่อคิดค่ากิจกรรมของเอนไซม์ต่อปริมาณโปรตีน 1 mg ใน cell free extract ซึ่งหาปริมาณโปรตีนโดยวิธี Lowry (Lowry, O.H. and others. 1951 : 265-275) และค่า Specific activity ของเอนไซม์ต่อปริมาณ crude enzyme ของ cell-free extract จึงทำให้ทราบค่าของ Specific activity ของเอนไซม์แอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนส
4. นำเส้นใยเห็ดที่เพาะเลี้ยงทั้ง 2 ชนิด มาใช้ในการหมักไวน์
นำเส้นใยเห็ดที่เพาะเลี้ยงได้ทั้ง 2 ชนิด มาใช้ในการหมักไวน์เพื่อให้ได้ไวน์ที่มีประสิทธิภาพที่ต้องการ โดยการเตรียมน้ำองุ่นเพื่อใช้ในการหมักไวน์ นำองุ่นเขียวมาชั่งน้ำหนักล้างทำความสะอาด คั้นเอาแต่น้ำให้ได้ปริมาตร 30 ml ปรับความเข้มข้นของน้ำตาลในน้ำองุ่นให้ได้ 22?Brix และปรับ pH ให้ได้ 5.8 (Okamura et al., 2001) จากนั้นนำไปนึ่งฆ่าเชื้อ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที รอจนน้ำองุ่นเย็น นำเส้นใยเห็ดที่เลี้ยงได้ในอาหารเหลวจากข้อ 2. มาเทใส่หลอดปั่นเหวี่ยงแล้วปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วรอบ 8,000 rpm เป็นเวลา 15 นาที เทส่วนใสทิ้งและนำเส้นใยที่เหลือนำมาหมักน้ำองุ่น และทำการเก็บตัวอย่างในสัปดาห์ที่ 0,1,2,3 และ 4 ของการหมักเพื่อนำน้ำหมักที่ได้ไปทำการวิเคราะห์ต่อไป
5. ศึกษาและวิเคราะห์หาปริมาณแอลกอฮอล์ และกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant activity) ในไวน์ที่ผลิตได้
5.1 ศึกษาและวิเคราะห์หาปริมาณแอลกอฮอล์
วิเคราะห์หาปริมาณแอลกอฮอล์ที่เกิดขึ้นโดยใช้ gas chromatograpy (shimadsu model GC-14) ระบบ FID (flame ionization detector) คอลัมน์ PEG 20 M สภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ อุณหภูมิคอลัมน์ 80?C อุณหภูมิของช่องที่ฉีดตัวอย่าง 120?C อุณหภูมิของช่อง detector 120?C และใช้ไนโตรเจนเป็น carrier gas อัตราไหล 50 มิลลิลิตรต่อนาที การเตรียมตัวอย่างเพื่อวิเคราะห์ โดยนำตัวอย่างที่ได้มาปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 10,000 rpm ประมาณ 5 นาที เพื่อเอาเซลล์และตะกอนออกจากสารละลายดูดเฉพาะของเหลวประมาณ 1 ml เก็บไว้ใน micro-tube ที่มีฝาปิดและเก็บในตู้เย็น 4?C วิธีการวิเคราะห์โดยใช้เข็มฉีดยาขนาด 10 ?l ดูดของเหลวตัวอย่างที่เตรียมไว้ 1 ?l ฉีดเข้าเครื่อง gas chromatograpy คำนวณหาปริมาณแอลกอฮอล์ในสารละลายตัวอย่างโดยเทียบกับ peak area ของแอลกอฮอล์มาตรฐาน (แอลกอฮอล์ 5%, 10%,15% และ 20%) ที่ฉีดเข้าไปแล้วทำการเปรียบเทียบหาปริมาณแอลกอฮอล์ที่มีอยู่ในสารละลาย และทำการวิเคราะห์หาปริมาณน้ำตาลที่เหลือโดยวิธี Samogi-Nelson (Sawhney and Rand |
| คำอธิบายโครงการวิจัย (อย่างย่อ) : | - |
| จำนวนเข้าชมโครงการ : | 754 ครั้ง |